国产视频一区二区-国产欧美日韩精品A在线观看-欧美高清不卡一区二区三区四区五区视频-日韩在线视频一区二区不卡-精品视频中文字幕一区二区

您當前的位置：首頁(yè) > 新聞動(dòng)態(tài) > 新聞中心

新聞動(dòng)態(tài)

News

酵母雜交--植物抗逆性研究好工具

2022-12-02文章來(lái)源：takarabiomed
酵母雜交--植物抗逆性研究好工具
 
眾所周知，植物需要應對持續變化的環(huán)境,包括經(jīng)常性的不利于植物生長(cháng)和發(fā)育的脅迫環(huán)境。這些不良環(huán)境包括生物脅迫(如病原體感染)和非生物脅迫(例如干旱、高溫、冷害、營(yíng)養匱乏、鹽害以及土壤中鋁、砷、鎘等有毒金屬毒害)，不僅影響農作物品質(zhì)，還對農業(yè)生產(chǎn)產(chǎn)生十分不利的影響，植物如何感受和響應逆境脅迫是一個(gè)根本性的生物學(xué)問(wèn)題。因此，開(kāi)展逆境脅迫的基礎研究、提高植物抗逆性顯得尤為重要。

酵母雜交作為研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-DNA之間相互作用的方法，因為其廣譜適應性、真實(shí)性、實(shí)驗操作簡(jiǎn)單、成本相對較低、通量大等特點(diǎn)也逐漸成為植物研究的重要工具，被廣泛應用于植物如何感受和響應逆境脅迫的研究中。
應用案例
生物脅迫-棉花對尖孢鐮刀菌的免疫反應
棉花枯萎病是由尖孢鐮刀菌引起的、發(fā)生在棉花的病害，是棉花生產(chǎn)中危害最嚴重的病害之一，曾被稱(chēng)為棉花的“癌癥”之一。對這種脅迫的適應涉及到復雜的感知、信號和脅迫反應機制。植物絲裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 級聯(lián)在介導植物生物和非生物脅迫的反應中起重要作用，并且是細胞外刺激作為信號在細胞內被轉導的主要途徑。其中GhMKK6-GhMPK4級聯(lián)信號通路在棉花免疫中起重要作用。分析GhMKK6-GhMPK4級聯(lián)信號通路在棉花抗枯萎病中的作用和調控機制顯得尤為重要。

為了分析被尖孢鐮刀菌攻擊的棉花的免疫反應，山東農業(yè)大學(xué)王琛課題組使用病毒誘導的基因沉默 (VIGS) 技術(shù)對GhMKK6下游的GhMPK4的功能進(jìn)行分析，結果表明沉默GhMPK4會(huì )降低棉花對枯萎病的耐受性，并降低某些抗性基因的表達。GhMPK4與GhMKK6的過(guò)度表達都會(huì )導致不利的棉花免疫反應特性。綜上，GhMPK4可能與SA通路介導的防御途徑有關(guān)，因此可能在棉花防御真菌中起重要作用。

為了進(jìn)一步研究植物在進(jìn)化過(guò)程中的反饋調控機制。以GhMPK4作為誘餌蛋白質(zhì)，利用Takara Matchmaker® Gold酵母雙雜交系統（Matchmaker® Gold Yeast Two-Hybrid System 630489)行酵母雙雜交篩選，在棉花中篩選并鑒定了MAPK激酶蛋白磷酸酶AP2C1的負調節因子。通過(guò)對AP2C1的一系列功能分析發(fā)現，GhAP2C1與GhMPK4相互作用調節棉花對尖孢鐮刀菌的免疫反應。以上結果，為功能分析和研究MAPK級聯(lián)的反饋調節機制提供了重要數據，有助于闡明MAPK級聯(lián)作用的調節機制以應對病原體。
 
非生物脅迫-水稻的磷酸鹽饑餓反應
磷是植物生長(cháng)和發(fā)育所必需的常量營(yíng)養素，磷缺乏限制了全球30%耕地的作物產(chǎn)量。闡明植物中的磷信號通路將為提高作物磷利用效率和優(yōu)化肥料施用提供信息。為了適應低磷環(huán)境，植物進(jìn)化出復雜的調控機制，盡管近年來(lái)植物對缺磷反應的分子機制取得了很大進(jìn)展，但植物響應和適應磷酸鹽缺乏的分子機制尚不清楚。

為了探明該機制，浙江大學(xué)毛傳澡課題組使用Takara Matchmaker® Gold酵母雙雜交系統（Matchmaker® Gold Yeast Two-Hybrid System 630489) 篩選與磷酸鹽反應抑制因子OsSPX4（SPX4）具有相互作用的蛋白，獲得了11個(gè)候選蛋白（25 個(gè)陽(yáng)性菌落），包括OsbHLH6（8 個(gè)菌落）、OsPHR2 同源物和7種其他蛋白質(zhì)。OsbHLH6（bHLH6）是一種編碼堿性螺旋-環(huán)-螺旋蛋白的未表征的磷饑餓反應基因。其中bHLH6和SPX4之間的相互作用通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)（Y2H）測定得到證實(shí)。為了確定bHLH6的哪個(gè)結構域與SPX4相互作用，作者檢測了SPX4與不同蛋白片段的bHLH6之間的相互作用。只有全長(cháng)bHLH6與SPX4強烈相互作用。運用免疫共沉淀（Co-IP）及雙分子熒光互補 (BiFC) 測定方法對SPX4與bHLH6在體內的相互作用進(jìn)行檢測，最終確定SPX4與bHLH6在體外和體內均有相互作用。

之后作者通過(guò)時(shí)空轉錄組、RT-qPCR、Pull down等研究分析得出結論，在磷缺乏的情況下，bHLH6的表達在芽中顯著(zhù)被誘導。bHLH6過(guò)表達系顯示出磷積累和增強的磷饑餓反應，包括磷饑餓誘導（PSI）基因的上調和更長(cháng)的根毛。bHLH6突變體在苗期沒(méi)有表現出顯著(zhù)的表型變異。與OsPHR2相比，bHLH6與SPX4的結合親和力更高，因此，bHLH6競爭性地抑制了SPX4和OsPHR2的相互作用。SPX4過(guò)表達挽救了在高磷和低磷條件下由 bHLH6過(guò)表達引起的磷積累。此外，在 SPX4背景中bHLH6的過(guò)表達不影響在高磷和低磷條件下SPX4的磷含量。bHLH6/SPX4雙突變體在高磷條件下與SPX4突變體相比，表現出較低的莖磷濃度和OsPT3和OsPT10的轉錄本豐度。RNA測序結果表明bHLH6 OV和SPX4共享許多差異表達的磷反應基因。因此，bHLH6是拮抗SPX4的磷信號傳導和穩態(tài)的重要調節因子。以上結果給闡明植物適應缺磷的分子調控提供了有力幫助，并將促進(jìn)對低磷耐受性作物的培育。
 
酵母雜交知識拓展
酵母雙雜交系統最初是由Fields等利用釀酒酵母GAL4轉錄因子的特性建立的，該研究成果被發(fā)表在《Nature》上。轉錄因子GAL4由兩個(gè)可分離且功能必需的結構域組成：一個(gè)與特定DNA序列（UASG）結合的N端結構域；另一個(gè)是激活轉錄所必需的C末端結構域，基于此特性，Fields生成了一個(gè)包含GAL4的兩種混合蛋白的系統：與蛋白質(zhì)“X”融合的GAL4 DNA結合域和與蛋白質(zhì)“Y”融合的GAL4激活區。如果X和Y可以形成蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)復合物并重建GAL4結構域的鄰近性，則會(huì )發(fā)生由UASG調節的基因的轉錄。使用兩種已知有相互作用的酵母蛋白——SNF1和SNF4對該系統進(jìn)行測試，結果只有當兩個(gè)融合蛋白都存在于細胞中時(shí)，才能獲得高轉錄活性。由此得出，酵母雜交系統可通過(guò)使用半乳糖（報告基因）選擇來(lái)識別與已知蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)。
目前，酵母雙雜交實(shí)驗采用的系統有LexA系統和GAL4系統兩種。在LexA系統中，DNA結合結構域由一個(gè)完整的原核蛋白LexA構成，轉錄激活結構域由一個(gè)來(lái)自大腸桿菌的88個(gè)氨基酸殘基組成的B42蛋白構成，它在酵母中可以活化基因的轉錄。

相較于LexA系統，GAL4系統的使用更加廣泛，其中比較有代表性的當屬Takara酵母雜交產(chǎn)品線(xiàn)--Matchmaker®系列產(chǎn)品（包括Matchmaker® Gold Yeast Two-Hybrid System、Make Your Own Mate & Plate Library System、Yeastmaker? Yeast Transformation System 2等眾多產(chǎn)品），提供文庫構建、大規模篩選和鑒別驗證一站式解決方案，自問(wèn)世以來(lái)，助力無(wú)數專(zhuān)家學(xué)者成功進(jìn)行蛋白質(zhì)互作研究，因其產(chǎn)品線(xiàn)完整、產(chǎn)品種類(lèi)豐富、假陽(yáng)性低，篩選高效，操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，受到各個(gè)領(lǐng)域學(xué)者的歡迎！

Takara Matchmaker®系列產(chǎn)品廣受歡迎，好評不斷，三大亮點(diǎn)搶先看。

首先，提供多種組織特異的均一化Mate & Plate?通用文庫，均一化處理降低了cDNA文庫中高豐度轉錄本所占的比例，篩選的克隆數更少，并且可以確保篩選到包含中等豐富和低等豐度轉錄本的克隆。您可以花費較少的精力篩選到更多的獨立克隆，并有更大的機會(huì )檢測到重要的互作，更加省時(shí)省力。其中，均一化的擬南芥文庫（Mate & Plate? Library - Universal Arabidopsis (Normalized) 630487）尤其受到各位植物研究學(xué)者的歡迎，擬南芥作為模式植物，被廣泛應用于植物生理學(xué)、分子生物學(xué)等多個(gè)研究領(lǐng)域。而該文庫由從擬南芥11個(gè)組織中分離的mRNA構建而成，等量混合并轉化到酵母菌株Y187中，提供完整的表達基因覆蓋，可以直接用于雙雜交篩選實(shí)驗。

如果Mate & Plate?中沒(méi)有適合您需要的文庫，您可使用 酵母雙雜交文庫構建系統（Make Your Own Mate & Plate Library System 630490）自己制作文庫，利用SMART cDNA合成技術(shù)，使用任意組織來(lái)源的低至100 ng的總RNA，即可構建cDNA文庫。一周之內即可構建足夠用于數百次酵母雙雜交篩選實(shí)驗所需要的文庫。文庫構建是在Y187文庫酵母菌株中通過(guò)酵母高效的同源重組機制直接完成的，無(wú)需傳統文庫構建過(guò)程中的一些繁冗的操作 (比如文庫克隆、擴增和大腸桿菌收集等)，操作更簡(jiǎn)單，性?xún)r(jià)比更高。
除此之外，您還可以委托Takara進(jìn)行cDNA文庫及酵母單雙雜交服務(wù)，服務(wù)種類(lèi)多樣，包括構建均一化、非均一化酵母單雜交、雙雜交文庫；單框、三框酵母文庫；物種不限、部位不限，所有真核生物都可構建！

其次，酵母雙雜交系統（Matchmaker® Gold Yeast Two-Hybrid System 630489），可以用于體內大規模的初步篩選蛋白質(zhì)相互作用候選目標，采用4個(gè)報告基因/3個(gè)不同bait識別序列的雙雜交系統，由于任何prey蛋白單獨結合引起假陽(yáng)性都需要識別3個(gè)不同序列，激活4個(gè)報告基因的表達，有效地降低了假陽(yáng)性。同時(shí)，報告基因中新型的、穩定的酵母雙雜交抗生素AbA（630466），可以有效殺死非抗性克隆，從而大大降低了背景克隆的生長(cháng)。

最后，對于蛋白質(zhì)互作結果驗證，除去使用酵母雙雜交系統（630489）反向驗證外，您還可以選擇免疫共沉淀方法進(jìn)行驗證，IP和Co-IP是研究蛋白質(zhì)與大分子（例如其他蛋白質(zhì)）之間相互作用的很有意義的實(shí)驗手段。Capturem? IP & Co-IP Kit（635721）應用于IP和Co-IP實(shí)驗，Takara特別的Capturem技術(shù)，實(shí)現了基于膜上的蛋白質(zhì)捕獲，從而使得免疫共沉淀純化部分的操作時(shí)間從傳統的數個(gè)小時(shí)縮減到5分鐘左右，使實(shí)驗效率顯著(zhù)提高。

不僅如此，Takara還提供適用于酵母雙雜交系統、文庫構建系統等的培養基及酵母質(zhì)粒提取、酵母轉化等各類(lèi)輔助試劑，滿(mǎn)足多種實(shí)驗需求。

Takara用心做產(chǎn)品，不辜負您的每一次期待，提供酵母雜交一站式解決方案，讓您的酵母雜交實(shí)驗更簡(jiǎn)單方便！
 
參考文獻：
Fields, S., & Song, O. (1989). A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature, 340(6230), 245 246.
Guo, D., Hao, C., et al. (2022). The Protein Phosphatase GhAP2C1 Interacts Together with GhMPK4 to Synergistically Regulate the Immune Response to Fusarium oxysporum in Cotton. International journal of molecular sciences, 23(4), 2014.
He, Q., Lu, H., et al. (2021). OsbHLH6 interacts with OsSPX4 and regulates the phosphate starvation response in rice. The Plant journal: for cell and molecular biology, 105(3), 649 667.
Nishimura, M. T., & Dangl, J. L. (2010). Arabidopsis and the plant immune system. The Plant Journal, 61(6), 1053-1066.
Oh, C. S., & Martin, G. B. (2011). Effector-triggered immunity mediated by the Pto kinase. Trends in plant science, 16(3), 132 140.
Raghothama K. G. (1999). Phosphate Acquisition. Annual review of plant physiology and plant molecular biology, 50, 665 693. Zhu J. K. (2016).
Abiotic Stress Signaling and Responses in Plants. Cell, 167(2), 313–324.