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微生物組測序

2022-08-12文章來(lái)源：takarabiomed
悟了，要想微生物組測序不難搞，選對方法很關(guān)鍵！
 
微生物雖然微小，但不可否認的是它們無(wú)處不在，與人類(lèi)有著(zhù)十分密切的關(guān)系。一方面我們與很多微生物和諧相處，比如腸道益生菌。而另一方面大量的病原微生物也給人類(lèi)的健康甚至生命帶來(lái)了巨大的威脅。因此，我們對微生物的研究始終都未曾停止過(guò)。

主要的研究方法包括經(jīng)典的培養鑒定法、血清學(xué)檢測、微生物核酸檢測（如RT-PCR法）以及NGS分析等多種方法。其中相較于傳統方式，NGS技術(shù)可以對疑難微生物以及難以培養的菌屬進(jìn)行核酸序列的測定（特別是在新型病原微生物流行監測方面），并且在檢測時(shí)間、通量上具有無(wú)可比擬的優(yōu)勢，因此逐漸成為微生物研究領(lǐng)域的重要方法。
 
mNGS，也稱(chēng)宏基因組測序技術(shù)，是研究環(huán)境或人體等樣本中所有以DNA為基因組的微生物遺傳物質(zhì)的技術(shù)，它的發(fā)展開(kāi)啟了微生物研究的新時(shí)代。這種技術(shù)不依賴(lài)微生物分離培養，可直接對臨床樣本中的核酸進(jìn)行檢測，分析微生物群落、以及微生物與宿主之間的相互關(guān)系。
 
ThruPLEX DNA-Seq Kit，實(shí)現對微量樣品的可靠宏基因組分析
在某些情況下，以非常少量的臨床樣本作為研究對象進(jìn)行宏基因組分析是難免的，這類(lèi)樣本包括臨床拭子、體液、少量組織等。ThruPLEX DNA-Seq Kit支持50 pg-50 ng DNA起始，單管操作、手動(dòng)15 min、總共兩小時(shí)，過(guò)程中無(wú)需轉管與純化，輕松應對宏基因組建庫難題！
 
■ 文獻案例
皮膚是人體最大的器官，“網(wǎng)羅”了各種各樣的微生物。多年來(lái)，雖然科研人員對涉及皮膚內穩態(tài)的微生物群落研究有了一些進(jìn)展，但對皮炎與微生態(tài)失衡之間是否關(guān)聯(lián)知之甚少。瑞典卡羅林斯卡醫學(xué)院的Dr. Nanna Fyhrquist團隊在Nature Communications雜志上發(fā)表了題為Microbe-host interplay in atopic dermatitis and psoriasis的文章，采用宏基因組學(xué)結合16s rRNA測序、宿主轉錄組測序分析技術(shù)，探討過(guò)敏性皮炎、銀屑病及健康人皮膚表面微生物群落特征，并與宿主皮膚轉錄組數據進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。
結果顯示，過(guò)敏性皮炎與銀屑病皮膚樣品具有各自特有的微生物群落特征，并都與健康人樣本的數據存在差異。其中，過(guò)敏性皮炎樣本的優(yōu)勢菌為Staphylococcus aureus，與皮膚屏障功能、色氨酸代謝及免疫激活等宿主轉錄組數據有相關(guān)性；銀屑病樣本顯示出共生的微生物群落結構，并與宿主疾病相關(guān)基因的表達存在弱相關(guān)性。
 
盡管mNGS 用于病原微生物檢測具有諸多優(yōu)勢，但其技術(shù)上往往還面臨著(zhù)一些挑戰：比如，樣本中宿主（例如人源）核酸的干擾。由于宿主基因組大小很可能遠大于微生物的基因組，目標基因片段在整體樣本中的含量較低，不僅會(huì )導致檢測成本偏高，甚至會(huì )出現目標基因片段太小而無(wú)法正確鑒定的假陰性結果。

針對上述這種情況，可以選擇采用多重PCR（multiplex PCR）測序。在提高靈敏度的前提下，可以大大減少測序數據量，實(shí)現性能及成本的雙優(yōu)化。

Tip: 多重PCR也稱(chēng)復合PCR，它是在常規PCR基礎上改進(jìn)并發(fā)展起來(lái)的一種新型PCR擴增技術(shù)。它的基本原理與常規PCR相同，區別在于多重PCR是在反應體系中加入了兩對以上引物，各對引物分別結合在模板相對應部位，最終擴增出兩條以上目的DNA片段。
 
>> 多重PCR測序的操作流程
 
>>多重PCR的優(yōu)勢

·不受宿主基因組及背景菌影響：只對目標微生物進(jìn)行檢測，PCR產(chǎn)物不包含宿主基因片段及背景菌群基因片段。
·實(shí)驗時(shí)間和成本雙雙降低：mNGS會(huì )對樣本中所有的核酸進(jìn)行檢測，而多重PCR測序只需針對特異性擴增片段檢測，大大降低了檢測時(shí)間和成本。

 
但多重PCR要想實(shí)現較好的擴增性能，需要考慮反應多方條件，具有較高的技術(shù)壁壘，而其中多重PCR酶的選擇也是重中之重，所以這里“墻裂”推薦↓
 
Multiplex PCR Assay Kit Ver.2
它是由能快速進(jìn)行Priming的酶與能很好提高引物退火特異性的反應液配套組成的Multiplex PCR用試劑盒。同以往Multiplex PCR Enzyme相比，可在短時(shí)間內特異性地進(jìn)行無(wú)偏差的PCR擴增。另外，調整酶量和反應時(shí)間也可對大約200對引物進(jìn)行Multiplex PCR。
 
■ 更加高效完成多重PCR反應的實(shí)驗例
 
■ 多重PCR測序的實(shí)驗例
使用Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2 和本產(chǎn)品、以人基因組DNA為模板對207個(gè)目的基因進(jìn)行Multiplex PCR，制備文庫后進(jìn)行NGS測序。
*The percentage of bases in all targeted regions (or whole genome) covered by at least 0.2× the average base read depth.
 
 
結果顯示，通過(guò)對約500萬(wàn)reads進(jìn)行測序，得到207個(gè)目的基因全部為500個(gè)reads以上，確認全部的目的基因可以被正確擴增！
 
 
我們相信，選擇合適的方法和試劑，會(huì )讓您的mNGS實(shí)驗事半功倍。