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Y2H+NGS，酵母雜交新思路！
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眾所周知，酵母雙雜交技術(shù) (Y2H) 是一種成熟的用于研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)。為滿(mǎn)足當前解開(kāi)復雜蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò )的需求，國內外學(xué)者通過(guò)對建立中高通量Y2H篩選平臺進(jìn)行調整，已成功將Y2H與下一代測序 (NGS) 技術(shù)相結合，以此來(lái)增加篩選的規模和方法的靈敏度。今天，小編就帶您了解一下其中兩個(gè)方法。
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■ 方法一：rec-YnH
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該方法能夠同時(shí)多對多檢測直接的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-RNA 相互作用。使用批量克隆、轉化與細胞內同源重組相結合的方法生成誘餌-獵物融合文庫，在液體凝膠中進(jìn)行相互作用選擇，并通過(guò)使用基于 ORF 序列的下一代測序（NGS）驗證相互作用，消除了現有方法所需的費力鋪板等步驟，工作流程更加簡(jiǎn)單且節省經(jīng)費。
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文獻案例
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Lang, Benjamin, et al. "Matrix-screening reveals a vast potential for direct protein-protein interactions among RNA binding proteins." Nucleic acids research (2021): 6702-6721.
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·背景
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RNA 結合蛋白 (RBPs) 是轉錄后基因調控的關(guān)鍵因素，RBP從轉錄的初始時(shí)刻開(kāi)始與 RNA 進(jìn)行相互作用，指導 RNA 加工、核輸出、細胞質(zhì)定位、翻譯和衰變等。RBP對于在時(shí)間、空間和細胞環(huán)境中引導基因表達至關(guān)重要，它的作用模式被深入研究，迄今為止，已經(jīng)發(fā)現了數百個(gè) RBP，并且已經(jīng)研發(fā)了許多方法來(lái)了解哪些 RNA 與哪些 RBP具有相互作用以及互作位置。盡管如此，RBP-RNA 相互作用的決定因素仍然是一個(gè)具有激烈爭議的研究領(lǐng)域。
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·方法
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為了系統地尋找直接的RBP相互作用，作者組裝了一個(gè)含有978個(gè)哺乳動(dòng)物RNA結合蛋白，76個(gè)微管相關(guān)蛋白（MAPs）的RBP庫，使用高通量重組酵母雙雜交（rec-Y2H）篩選來(lái)檢測1054個(gè)蛋白質(zhì)之間>100萬(wàn)個(gè)相互作用。
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·說(shuō)明
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本文作者使用了Takara的Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System進(jìn)行rec-Y2H分析，Matchmaker Gold酵母雙雜交系統用于研究蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用。系統是采用3個(gè)啟動(dòng)子、4個(gè)報告基因共同篩選，有效降低假陽(yáng)性！
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·結論
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最終檢測到1994種新的RBP相互作用, 同時(shí)驗證了422種以前報道的相互作用。還發(fā)現RBP的mRNA結合區域和基序偏好會(huì )因為他們相鄰的結合互作伙伴不同而有所不同，揭示了主要 RNA 加工步驟之間新的RBP相互作用網(wǎng)絡(luò )，并發(fā)現了在癌癥中觀(guān)察到的剪接損傷RBP突變重新連接剪接體相互作用網(wǎng)絡(luò )。這些數據有助于理解蛋白質(zhì)-RNA 相互作用、RNA 代謝和基因表達的基本原理。
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■ 方法二：Y2H-seq
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將Y2H篩選與下一代測序 (NGS) 相結合，可以減少工作量和成本，同時(shí)提高靈敏度，并且能夠快速識別所選生物體中感興趣的誘餌蛋白質(zhì)的相互作用蛋白質(zhì)。選定的誘餌蛋白質(zhì)和數以千計的獵物蛋白質(zhì)以陣列形式生長(cháng)，分別配對匯集。NGS縮小了獵物池的范圍，最終通過(guò)選擇性培養基上的大規模斑點(diǎn)分析檢測相互作用。Y2H-seq 篩選方法生成定量讀數，通過(guò)控制篩選可以消除假陽(yáng)性以提高特異性，從而可以減少下游一對一相互作用驗證實(shí)驗。此外，該方法依賴(lài)于 cDNA文庫，適用于所有生物體。
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文獻案例
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Chen, Xi, et al. "Determination of conifer age biomarker DAL1 interactome using Y2H-seq." Forestry Research (2021): 1-12.
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·背景
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年齡作為一種復雜的生理信號，可確保生物體不同發(fā)育階段的順序。對于針葉樹(shù)種，通常具有十分漫長(cháng)的童期，且針葉樹(shù)具有明顯的年齡效應，無(wú)性繁殖困難，所以針葉樹(shù)年齡決定機制的全面解析至關(guān)重要。DAL1曾被鑒定為油松年齡標志因子，在油松從營(yíng)養生長(cháng)階段到生殖生長(cháng)階段的過(guò)渡中起重要的作用，闡明與 DAL1 相關(guān)的相互作用是了解年齡如何驅動(dòng)油松發(fā)育的關(guān)鍵。
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·方法
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作者開(kāi)發(fā)Y2H-seq 方法，運用該方法對油松年齡標志因子DAL1互作蛋白進(jìn)行了大規模篩選。
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·說(shuō)明
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在 Y2H 檢測中，使用了Takara 的pGBKT7 (DNA-BD) 和 pGADT7 (AD)載體；用于構建誘餌蛋白質(zhì)PtDAL1 和不同年齡段油松cDNA文庫；這兩個(gè)載體作為Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System的組分，在酵母雙雜交中被廣泛使用。
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·結論
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共鑒定出與油松PtDAL1具有直接相互作用的蛋白質(zhì)135個(gè)，這些蛋白質(zhì)具有由轉錄因子 (TF)、轉錄調節因子 (TR) 和激酶組成的復雜相互作用網(wǎng)絡(luò )，與衰老過(guò)程有關(guān)；同時(shí)，這些蛋白質(zhì)是響應多種植物激素而產(chǎn)生的環(huán)境信號，可能參與木材形成、針葉發(fā)育、油樹(shù)脂萜類(lèi)生物合成和生殖發(fā)育過(guò)程。本文作者提出了一種油松衰老的新調控模型，PtDAL1通過(guò)協(xié)調環(huán)境刺激并與多種重要調控因子產(chǎn)生相互作用，從而調節油松不同年齡段的生長(cháng)發(fā)育，為油松及其它相關(guān)針葉樹(shù)種年齡調控機制研究提供了科學(xué)依據。
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酵母雙雜交 (Y2H) 與下一代測序 (NGS) 的結合，加大了篩選互作規模的同時(shí)提高靈敏度，減輕了實(shí)驗數據采集和重復篩選的勞動(dòng)力成本，為繪制大規模的蛋白互作網(wǎng)絡(luò )圖譜提供了可能，給廣大科研學(xué)者帶來(lái)研究大規模蛋白質(zhì)互作高效的新思路！
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參考文獻！
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1. Erffelinck, Marie-Laure, et al. "A user-friendly platform for yeast two-hybrid library screening using next generation sequencing." PLoS One (2018): e0201270.
2. Yang, Jae-Seong, et al. "rec-YnH enables simultaneous many-by-many detection of direct protein–protein and protein–RNA interactions." Nature communications (2018): 1-13.
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