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一款合成高質(zhì)量、高產(chǎn)量mRNA的體外轉錄（IVT）試劑盒
·通過(guò)體外轉錄（IVT）合成帶有Cap結構和Poly(A)序列的mRNA；
·優(yōu)化的T7 RNA聚合酶用于IVT反應，RNA合成效率高、產(chǎn)量大；
·獨立包裝的NTPs，方便修飾NTPs替換，且不影響mRNA產(chǎn)量；
·采用In-Fusion無(wú)縫克隆，輕松構建模板質(zhì)粒DNA；
·使用氯化鋰（LiCl）溶液進(jìn)行RNA純化，可立即進(jìn)行下游應用。
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■ 制品說(shuō)明
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Takara IVTpro? mRNA Synthesis System是能夠簡(jiǎn)便、高效合成帶有Cap結構和Poly(A)序列的mRNA的體外轉錄試劑盒。它包含以下兩種制品：
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① Cloning Kit for mRNA Template（Code No. 6143）：
本試劑盒用于將模板DNA無(wú)縫克隆到預線(xiàn)性化載體（包含在本試劑盒中）中構建用于體外轉錄反應的模板質(zhì)粒。預線(xiàn)性化載體中包含T7 啟動(dòng)子、轉錄起始序列 (AGG)、5'-UTR（非編碼區）、3'-UTR、和105-base Poly(A) 序列。試劑盒還包含用于將目標DNA無(wú)縫克隆到預線(xiàn)性化載體的In-Fusion Snap Assembly Master Mix和FLuc對照片段（包括15 bp，3' In-Fusion sequence；FLuc CDS；和15 bp，5' In-Fusion sequence）。
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② Takara IVTpro T7 mRNA Synthesis Kit（Code No. 6144）：
本試劑盒以含有 T7 啟動(dòng)子序列的雙鏈 DNA 為模板，使用優(yōu)化的高效T7 RNA聚合酶，通過(guò)體外轉錄可合成大量mRNA。除此以外，還包含用于IVT反應后消化模板DNA的DNase I和用于純化mRNA的氯化鋰 (LiCl) 溶液。真核細胞翻譯蛋白質(zhì)需要RNA的5'端有Cap結構，本試劑盒配合使用CleanCap Reagent AG（TriLink公司的Cap類(lèi)似物）可以高效制備具有Cap結構的mRNA。另外，試劑盒包含單獨的NTPs，方便優(yōu)化或使用修飾NTPs如假尿苷替換，而且不會(huì )明顯降低mRNA的產(chǎn)量。使用本產(chǎn)品，每次反應（20 μl 反應體系）可以合成高達 200μg 或更多的RNA?？梢愿鶕枰糯蠓磻w系，即使使用10倍（200μl）反應體系也不影響mRNA預期產(chǎn)量（請參考說(shuō)明書(shū)實(shí)驗例）?！鵆ap類(lèi)似物不包含在本產(chǎn)品中，請另外準備CleanCap Reagent AG (TriLink公司)。
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使用Takara IVTpro? 系統合成 mRNA時(shí)，通過(guò)In-Fusion方法克隆目標基因（GOI）后，使用不會(huì )在 Poly (A) 下游留下額外序列的限制性?xún)惹忻盖懈钍欠浅Ｖ匾?。強烈建議使用 Hind III（Code No. 1060A/B）對用于mRNA合成的質(zhì)粒進(jìn)行線(xiàn)性化（請參考說(shuō)明書(shū)和載體圖譜信息）。
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■ 用途
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· 用于體外轉錄（IVT）質(zhì)粒模板DNA的構建
· 配合使用TriLink公司的CleanCap Reagent AG體外轉錄合成mRNA
· 使用其它Cap類(lèi)似物如Anti-Reverse Cap Analog (ARCA)合成帶帽結構的mRNA
(* 請注意，使用ARCA時(shí)，需要設計與本產(chǎn)品不同的模板序列。)
· 用于長(cháng)鏈非編碼RNA（Long non-coding RNA）的合成
· 向導RNA（guide RNA）的合成
· siRNA前體的合成
· 用于RT-qPCR的RNA標準模板的合成
· RNA探針的合成
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■ 制品內容
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Cloning Kit for mRNA Template（Code No. 6143）（10次反應）
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產(chǎn)品組分
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體積量
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件數/Kit
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1. Linearized Template Vector (50 ng/μl)
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10 μl
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1
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2. FLuc Control Fragment (100 ng/μl) ＊1
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10 μl
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1
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3. 5X In-Fusion Snap Assembly Master Mix
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20 μl
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1
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*1：由 In-Fusion 序列 (15 bp) + FLuc-CDS + In-Fusion 序列 (15 bp) 組成的對照片段 (1,683 bp)
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Takara IVTpro T7 mRNA Synthesis Kit（Code No. 6144）（20次量、20 μl反應體系）
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產(chǎn)品組分
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體積量
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件數/Kit
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1. 10X Transcription Buffer
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40 μl
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1
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2. 10X ATP
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40 μl
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1
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3. 10X CTP
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40 μl
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1
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4. 10X GTP
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40 μl
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1
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5. 10X UTP
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40 μl
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1
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6. 10X Enzyme Mix
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40 μl
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1
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7. Nuclease-Free Water
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1 ml
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3
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8. DNase I
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80 μl
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1
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9. Lithium Chloride Precipitation Solution
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600 μl
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1
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10. Positive Control Template (FLuc) (0.5 μg/μl)＊2
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10 μl
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1
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*2：由T7 啟動(dòng)子 + 5'UTR + FLuc-CDS + 3'UTR + Poly (A) 序列組成的線(xiàn)性質(zhì)粒DNA。
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■ 實(shí)驗操作注意事項
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· 本制品是通過(guò)IVT反應合成RNA的試劑。如果雙鏈DNA模板、試劑、試管、微量移液器吸頭或反應中使用的其他材料混入RNase污染，會(huì )導致使用本試劑盒獲得的RNA收量降低或片段化。在反應中使用專(zhuān)用試管和微量移液器吸頭，并戴上新的一次性手套以防止RNase污染。
· 10X Enzyme Mix 不要劇烈攪拌。
· 使用前將Lithium Chloride Precipitation Solution在室溫下融化。融解后，如果充分混合后仍可見(jiàn)沉淀，可37℃保溫溶解。如果仍有沉淀物，請直接使用，對性能沒(méi)有影響。
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■ 保存
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-20℃
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■ 試劑盒以外的其它必要試劑（主要試劑）
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· CleanCap Reagent AG（TriLink公司）
· 修飾NTPs
· 限制酶（Hind III等等）
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■ 序列信息 FLuc Control Fragment
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序列信息（fasta格式）：點(diǎn)此進(jìn)行下載
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該序列與Positive Control Template（FLuc）中2,685～4,367（1,683 bp）的序列相同。
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NeoR/KanR: 53～847
Ori: 1,172～1,760
CMV enhancer: 1,861～2,240
CMV promoter: 2,241～2,444
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T7 promoter sequence: 2,489～2,505
Transcription start sequence (AGG): 2,506～2,508
5’UTR: 2,509～2,559
Upstream In-Fusion region (15 bp): 2,545～2,559
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In-Fusion cloning site (linearized site): between 2,559 and 2,560
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Downstream In-Fusion region (15 bp): 2,560～2,574
3’UTR: 2,560～2,672
Poly(A)105: 2,673～2,77
Restriction enzyme sites for plasmid linearization: 2,776～2,801(Hind III, Xho I, Sal I, Avr II, BamH I)
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Poly(A) Forward Primer: 2,570～2,589
Poly(A) Reverse Primer: 2,863～2,882
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<T7啟動(dòng)子后序列的詳細信息>
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■ 載體信息 Positive Control Template（FLuc）
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序列信息（fasta格式）：點(diǎn)此進(jìn)行下載
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Positive Control Template（FLuc）（4,574 bp）
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NeoR/KanR: 193～987
Ori: 1,312～1,900
CMV enhancer: 2,001～2,380
CMV promoter: 2,381～2,584
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T7 promoter sequence: 2,629～2,645
Transcription Start Sequence (AGG): 2,646～2,648
5’UTR: 2,649～2,699
FLuc CDS: 2,700～4,352
3’UTR: 4,353～4,465
Poly(A)105: 4,466～4,570 (FLuc Control Fragment-derived sequence: 2,685～4,367)
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Linearized site by Hind III (5' overhangs) : 4,569 (4,573)
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＜T7啟動(dòng)子后序列的詳細信息＞
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