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mRNA疫苗研究解決方案
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新冠疫情的出現讓疫苗再次備受關(guān)注。作為“疫苗軍團”中的一員，mRNA疫苗作為后起之秀熱度不斷攀升。
體外轉錄的mRNA應用在動(dòng)物實(shí)驗的首次報道是在1990年，研究人員將報告基因的mRNA注射入小鼠骨骼肌，并成功檢測到蛋白質(zhì)的表達。然而，由于這一時(shí)期缺少高效的mRNA遞送技術(shù)，加之RNA本身的不穩定性等原因，在這一階段的研究過(guò)后，mRNA療法并沒(méi)有走上快速發(fā)展的道路。隨著(zhù)相關(guān)研究的不斷投入，近年來(lái)涌現的各種創(chuàng )新型技術(shù)讓mRNA在疫苗研發(fā)領(lǐng)域嶄露頭角，表現出很好的前景。
相比滅活疫苗等前代技術(shù)平臺，mRNA技術(shù)在安全性、功效表現，以及生產(chǎn)上均具有一定優(yōu)勢。mRNA不具備感染性、整合性，降低了發(fā)生感染或插入突變帶來(lái)的潛在風(fēng)險。各種修飾技術(shù)幫助mRNA提高了穩定性與可翻譯性，新的遞送方法讓mRNA可以快速進(jìn)入到細胞中完成表達。此外這些新技術(shù)新方法也為其安全性提供了進(jìn)一步保障。通過(guò)體外轉錄技術(shù)，mRNA可以被快速、大量地合成，讓mRNA也同時(shí)具備了生產(chǎn)優(yōu)勢。
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Takara mRNA疫苗研究解決方案，為疫苗研發(fā)加速。
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mRNA體外合成
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生產(chǎn)mRNA主要通過(guò)體外合成方式進(jìn)行，體系中RNA聚合酶以DNA為模板體外轉錄得到mRNA。Takara提供多種mRNA合成工具酶及相關(guān)試劑。
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2540A
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T7 RNA Polymerase
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5,000 U
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2540B
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T7 RNA Polymerase
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5,000 U ×5
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2520A
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SP6 RNA Polymerase
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3,000 U
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2520B
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SP6 RNA Polymerase
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3,000 U ×5
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2181
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Poly(A) Polymerase
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20 U
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2270A
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Recombinant DNase I (RNase-free)
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1,000 U
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2270B
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Recombinant DNase I (RNase-free)
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1,000 U ×5
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2313A
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Recombinant RNase Inhibitor
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5,000 U
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2313B
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Recombinant RNase Inhibitor
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5,000 U ×5
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4041
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ATP
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25 μmol
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4042
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GTP
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25 μmol
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4043
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CTP
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25 μmol
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4044
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UTP
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25 μmol
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6141
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Takara
IVTpro? mRNA Synthesis System
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1
Kit
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6143
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Cloning
Kit for mRNA Template
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10
Rxns
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6144
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Takara
IVTpro? T7 mRNA Synthesis Kit
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20
Rxns
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2541A
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T7
RNA Polymerase ver.2.0
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20000
U
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2450A
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Pyrophosphatase
(inorganic)
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10
U
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2450B
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Pyrophosphatase
(inorganic)
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10
U x5
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新產(chǎn)品：Takara IVTpro? mRNA Synthesis System（Code No. 6141）
它是一款能夠簡(jiǎn)便、高效合成帶有Cap結構和Poly(A)序列的mRNA的體外轉錄試劑盒。
它包含以下兩種制品組分：
1）Cloning Kit for mRNA Template（Code No. 6143）：用于構建參與體外轉錄反應的模板質(zhì)粒。
試劑盒包含一個(gè)預線(xiàn)性化載體，作為模板質(zhì)粒用于后續體外轉錄反應。此外還包含用于將目標DNA無(wú)縫克隆到預線(xiàn)性化載體的In-Fusion Snap Assembly Master Mix和FLuc對照片段。
2）Takara IVTpro T7 mRNA Synthesis Kit（Code No. 6144）：用于體外轉錄反應大量生成高質(zhì)量的mRNA。
試劑盒中含有優(yōu)化的高效T7 RNA聚合酶，獨立包裝的NTPs，通過(guò)體外轉錄可合成大量mRNA。此外，還包含用于IVT反應后消化模板DNA的DNase I和用于純化mRNA的氯化鋰 (LiCl) 溶液。
本試劑盒配合使用CleanCap Reagent AG（TriLink公司的Cap類(lèi)似物）可以高效制備具有Cap結構的mRNA。
※Cap類(lèi)似物不包含在本產(chǎn)品中，需另外準備CleanCap Reagent AG (TriLink公司)。
新產(chǎn)品6141適用于目前研究熱點(diǎn)mRNA疫苗相關(guān)應用。
它是一個(gè)完整的系統，包含一個(gè)帶有T7啟動(dòng)子的DNA模板質(zhì)粒（6143）和IVT反應相關(guān)試劑（6144），直接滿(mǎn)足客戶(hù)從無(wú)到有，對mRNA合成工具的需求。
6143中帶有的in-fusion試劑可以幫助客戶(hù)直接將目的基因克隆到DNA模板上，方便進(jìn)行后續體外轉錄實(shí)驗。使用6141每次反應（20 μl 反應體系）可以合成高達 200μg 或更多的RNA，在mRNA合成產(chǎn)量上在市面同類(lèi)競爭產(chǎn)品中具有優(yōu)勢！
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修飾酶新品：
1、2541A T7 RNA Polymerase ver.2.0
2541A是原有產(chǎn)品T7 RNA Polymerase（Code No. 2540A/B）的升級產(chǎn)品，每個(gè)反應（20μl體系）的RNA合成量提高約7倍，性能更強！
2、2450A/B Pyrophosphatase (inorganic)
2450A/B是焦磷酸酶（無(wú)機）是一種催化無(wú)機焦磷酸鹽（PPi）水解產(chǎn)生正磷酸鹽的酶。該酶分解RNA和DNA合成反應中產(chǎn)生的副產(chǎn)物PPi，可促進(jìn)合成反應的順利進(jìn)行。
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mRNA轉染
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進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗前，將mRNA轉染細胞是初步驗證所合成的mRNA是否有效的方法之一。Takara Xfect RNA轉染試劑可以高效轉染多種類(lèi)型RNA至哺乳動(dòng)物細胞，是包含轉染所需全部試劑的完整系統。
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貨號
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產(chǎn)品名稱(chēng)
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規格
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631450
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Xfect RNA Transfection Reagent
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1.2 ml
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Xfect是可生物降解的納米顆粒高分子聚合物轉染試劑，可提供更低的細胞毒性和高轉染效率，適用于廣泛的細胞類(lèi)型，保證高轉染效率的同時(shí)保持了更高的細胞活性。
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實(shí)驗例
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圖1. HeLa細胞與間充質(zhì)干細胞（MSCs）轉染GFP mRNA。HeLa細胞（2.0×105）和間充質(zhì)干細胞（6.0×104）使用1 μg GFP mRNA和5 μl Xfect RNA轉染試劑進(jìn)行處理。20小時(shí)后，通過(guò)落射熒光顯微鏡進(jìn)行觀(guān)察。HeLa細胞圖像20倍放大，間充質(zhì)干細胞圖像40倍放大。
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轉染細胞中目標蛋白表達檢測（Western Blot分析）
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Western Blot分析仍然是目前實(shí)驗室常用的檢測分析方法之一，廣泛應用于對目標蛋白質(zhì)的檢測與分析。轉染細胞后的mRNA會(huì )獲得怎樣的表達情況，通過(guò)Western Blot檢測可以獲得一目了然的結果。Takara提供豐富的Western Blot實(shí)驗相關(guān)試劑，搭配詳細的實(shí)驗操作指南，提高Western Blot實(shí)驗效率。
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化學(xué)發(fā)光檢出用HPR底物
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貨號
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產(chǎn)品名稱(chēng)
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規格
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T7101A
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Western BLoT Chemiluminescence HRP Substrate
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250 ml
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T7101B
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Western BLoT Chemiluminescence HRP Substrate
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250 ml × 2
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T7102A
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Western BLoT Quant HRP Substrate
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100 ml
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抗原-抗體反應促進(jìn)
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貨號
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產(chǎn)品名稱(chēng)
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規格
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T7111A
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Western BLoT Immuno Booster
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250 ml each
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T7115A
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Western BLoT Immuno Booster PF
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250 ml
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HPR標識二抗替代
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貨號
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產(chǎn)品名稱(chēng)
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規格
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T7122A
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Western BLoT Rapid Detect v2.0
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50 Rxns
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封閉與洗脫
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貨號
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產(chǎn)品名稱(chēng)
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規格
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T7131A
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Western BLoT Blocking Buffer（Fish Gelatin）
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1 L
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T7132A
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Western BLoT Blocking Buffer（Protein Free）
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500 ml
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T7135A
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Western BLoT Stripping Buffer
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500 ml
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電泳緩沖液方便裝與蛋白質(zhì)Marker
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貨號
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產(chǎn)品名稱(chēng)
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規格
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3453A
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CLEARLY Protein Ladder (Unstained)
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500 μl
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3454A
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CLEARLY Stained Protein Ladder
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500 μl
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T9320A
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TaKaRa CBB Protein Safe Stain
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1 L
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Western Blot實(shí)驗操作指南
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病毒RNA檢測
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動(dòng)物實(shí)驗是檢驗疫苗效果的重要一環(huán)。這其中少不了對不同實(shí)驗組別動(dòng)物體內病毒載量的檢測。除了經(jīng)典的組織病理學(xué)、免疫組化方法外，快速、靈敏的熒光定量PCR方法同樣不可少。Takara提供高質(zhì)量的病毒核酸檢測相關(guān)產(chǎn)品，加速研究進(jìn)程。
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探針?lè )ㄒ徊絉T-PCR試劑與病毒核酸提取
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貨號
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產(chǎn)品名稱(chēng)
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規格
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RR064A
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One Step PrimeScript? RT-PCR Kit (Perfect Real Time)
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100 Rxns
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RR064B
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One Step PrimeScript? RT-PCR Kit (Perfect Real Time)
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100 Rxns × 5
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RR600A
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One Step PrimeScript? III RT-qPCR Mix
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200 Rxns
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RR600B
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One Step PrimeScript? III RT-qPCR Mix
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200 Rxns × 5
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9766
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TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0
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50 Rxns
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【文獻案例】
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· Huang, Qingrui, et al. “A Single-Dose MRNA Vaccine Provides a Long-Term Protection for HACE2 Transgenic Mice from SARS-CoV-2.” Nature Communications, vol. 12, no. 1, 2021, pp. 776–776.
· Zhang, Na Na, et al. “A Thermostable MRNA Vaccine against COVID-19.” Cell, vol. 182, no. 5, 2020, pp. 1271–1283.
· Zhang, Cheng, et al. “Impact of Prior Infection on Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 Transmission in Syrian Hamsters.” Frontiers in Microbiology, vol. 12, 2021, pp. 722178–722178.
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疫苗的研發(fā)是一場(chǎng)與病毒的賽跑?？萍疾粩喟l(fā)展，技術(shù)不斷進(jìn)步，人類(lèi)的腳步從未停止向前。mRNA疫苗以及更多基于mRNA技術(shù)的治療方法將為人類(lèi)的健康以及公共衛生安全事業(yè)持續貢獻力量
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Takara為不同基因工程疫苗研究提供多種解決方案，點(diǎn)擊下方專(zhuān)題，了解更多信息。
《重組腺病毒疫苗研究解決方案》
《重組蛋白疫苗研究解決方案》
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參考文獻
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· Wolff, Jon A., et al. “Direct Gene Transfer into Mouse Muscle in Vivo.” Science, vol. 247, no. 4949, 1990, pp. 1465–1413.
· Pardi, Norbert, et al. “mRNA Vaccines — a New Era in Vaccinology.” Nature Reviews Drug Discovery, vol. 17, no. 4, 2018, pp. 261–279.
· Karikó, Katalin, et al. “Incorporation of Pseudouridine into mRNA Yields Superior Nonimmunogenic Vector with Increased Translational Capacity and Biological Stability.” Molecular Therapy, vol. 16, no. 11, 2008, pp. 1833–1840.
· Kauffman, Kevin J., et al. “Materials for Non-Viral Intracellular Delivery of Messenger RNA Therapeutics.” Journal of Controlled Release, vol. 240, 2016, pp. 227–234.
· Guan, S., and J. Rosenecker. “Nanotechnologies in Delivery of mRNA Therapeutics Using Nonviral Vector-Based Delivery Systems.” Gene Therapy, vol. 24, no. 3, 2017, pp. 133–143.
· Thess, Andreas, et al. “Sequence-Engineered mRNA Without Chemical Nucleoside Modifications Enables an Effective Protein Therapy in Large Animals.” Molecular Therapy, vol. 23, no. 9, 2015, pp. 1456–1464.
· Karikó, Katalin, et al. “Generating the Optimal mRNA for Therapy: HPLC Purification Eliminates Immune Activation and Improves Translation of Nucleoside-Modified, Protein-Encoding mRNA.” Nucleic Acids Research, vol. 39, no. 21, 2011.
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