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重組蛋白疫苗研究解決方案
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關(guān)于SARS-CoV-2的疫苗研究，識別可能引發(fā)對該病毒的免疫反應的抗原決定簇，這是開(kāi)發(fā)新疫苗的重要一步。Takara Bio提供了一系列創(chuàng )新技術(shù)來(lái)支持這項工作。疫苗的研發(fā)包括利用測序和生物信息學(xué)分析病毒及宿主基因組以確定潛在的靶標，克隆和分離候選抗原決定簇，測試動(dòng)物模型的免疫反應，最后對主要候選對象進(jìn)行臨床試驗。
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病毒與宿主的基因組學(xué)
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SARS-CoV-2病毒的全基因組測序，可以提供有價(jià)值的有關(guān)可能引發(fā)免疫反應的潛在抗原決定簇信息。Takara Bio的SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian在中國已用于SARS-CoV-2測序，以獲得病毒的全基因組序列。通過(guò)對COVID-19感染者或康復者進(jìn)行免疫分組庫分析，可為進(jìn)一步促進(jìn)抗原和疫苗靶標識別提供更多信息。高靈敏度的SMARTer Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kit和SMARTer Human TCR a/b Profiling Kit v2可用于監測從感染到康復過(guò)程中BCR（B細胞受體）和TCR（T細胞受體）的克隆型變化。
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SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian
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· 250 pg-10 ng 的total RNA起始量，樣本稀少也能高效建庫！
· 專(zhuān)為低質(zhì)量樣本設計，無(wú)需進(jìn)行rRNA前處理操作！
· 隨機引物起始，6小時(shí)內即可制備高質(zhì)量文庫！
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SMARTer Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kit
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· 可從外周血單核細胞（PBMC）純化的10 ng-1μg的總RNA或從B細胞純化的1-100 ng的總RNA起始，正確擴增并通過(guò)測序鑒別人IgG亞類(lèi)
· 添加UMI，可校正來(lái)自PCR錯誤、重復序列以及序列錯誤的讀取
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SMARTer Human TCR a/b Profiling Kit v2
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· 支持total RNA(10 ng-1 μg外周血淋巴細胞來(lái)源或 1 ng-100 ng T細胞來(lái)源 total RNA)，或者純化后完整的T細胞（1,000-10,000個(gè)）起始
· 每次反應僅需一對引物擴增相應的TCR亞基
· 引入UMI建庫，校正PCR偏差及測序錯誤產(chǎn)生的reads
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已有研究人員在針對SARS-CoV-2研究過(guò)程中使用了SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian ，這些工作現已發(fā)表：
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· Wu, F. et al., A new coronavirus associated with human respiratory disease in China . Nature. Mar;579(7798):265 269. (2020)
· Lu, Jing et al. Genomic Epidemiology of SARS CoV 2 in Guangdong Province, China. Cell vol. 181,5
· Pfefferle, Susanne et al. Complete Genome Sequence of a SARS CoV 2 Strain Isolated in Northern Germany. Microbiology resource announcements vol. 9,23 (2020)
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生物信息學(xué)分析
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接下來(lái)的一步是對病毒基因組和宿主的BCR和TCR免疫組庫進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以揭示SARS-CoV-2的抗原，并選擇疫苗靶標（病毒表面受體）。Takara Bio的Immune Profiler Software可與SMARTer Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kit配合使用，以分析有關(guān)克隆型數量和可變區V（D）J序列的信息。
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疫苗靶標的克隆
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研究人員可以利用Cloning Enhancer，質(zhì)粒純化試劑盒，Stellar感受態(tài)細胞以及In-Fusion無(wú)縫克隆技術(shù)來(lái)進(jìn)行高通量克隆，從而加快病毒受體和疫苗載體的構建：
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· 高效——對于0.5～15 kb的插入片段，克隆效率可超過(guò)95%
· 不依賴(lài)序列——可在任意載體的任意位置進(jìn)行任意片段的克隆
· 無(wú)縫連接——克隆連接處無(wú)多余的堿基對（或疤痕序列）
· 一盒多用——只需一個(gè)試劑盒就可進(jìn)行多片段克隆和定點(diǎn)誘變
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已有研究人員在研發(fā)針對冠狀病毒（包括SARS-CoV-2）疫苗的過(guò)程中使用了In-Fusion克隆技術(shù)，這些工作現已發(fā)表：
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· Kato, H. et al. Development of a recombinant replication-deficient rabies virus-based bivalent-vaccine against MERS-CoV and rabies virus and its humoral immunogenicity in mice. PLoS One. 14, DOI:10.1371/journal.pone.0223684 (2019).
· Letko, L., Marzi, A., & Munster, V. Functional assessment of cell entry and receptor usage for SARSCoV-2 and other lineage B betacoronaviruses. Nat. Microbiol. 6, 562-569 (2020).
· Terada, Y., Kawachi, K., Matsuura, Y., Wataru, W., Kamitani, W. MERS coronavirus nsp1 participates in an efficient propagation through a specific interaction with viral RNA. Virol. 511, 95-105 (2019).
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表達和純化疫苗靶標
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您可以使用BacPAK桿狀病毒表達系統來(lái)表達您感興趣的蛋白質(zhì)，以用于疫苗開(kāi)發(fā)。該技術(shù)易于擴大規模，蛋白質(zhì)表達水平高，對人體無(wú)致病性。此外，該系統產(chǎn)生的靶蛋白在結構、生物活性以及免疫反應性方面與天然蛋白質(zhì)都是相似的。為了優(yōu)化重組蛋白質(zhì)的表達水平，可以使用BacPAK Baculovirus Rapid Titer Kit快速確定病毒的滴度，該試劑盒使用標準免疫測定法在48小時(shí)內即可準確測定桿狀病毒滴度，而斑塊和終點(diǎn)稀釋測定法通常需要5-10天。一旦靶蛋白從這些純化的產(chǎn)物中表達出來(lái)，就可以使用我們的Capturem新型高容量膜純化技術(shù)來(lái)快速純化His標簽標記的疫苗候選蛋白：
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· 快速、方便的工作流程——Capturem膜上偶聯(lián)鎳離子作為配基，使用方便的純化柱/純化板/過(guò)濾裝置，室溫下操作僅需5-30分鐘
· 高純度——柱床體積小，帶入污染少
· 兼容多種添加劑——包括EDTA、DTT、BME、甘油、TCEP等（兼容試劑一覽表）
· 通用性——易于從哺乳動(dòng)物/細菌的細胞裂解液和上清液中純化
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已有研究人員在疫苗開(kāi)發(fā)工作中使用我們的Capturem His技術(shù)發(fā)表了研究成果：
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· Do, V. T. et al. Recombinant adenovirus carrying a core neutralizing epitope of porcine epidemic diarrhea virus and heat-labile enterotoxin B of Escherichia coli as a mucosal vaccine. Arch. Virol. 165, 609-618 (2020).
· Martínez-Hernández, S. L. et al. An anti-amoebic vaccine: generation of the recombinant antigen LC3 from Entamoeba histolytica linked to mutated exotoxin A(PEΔIII) via the Pichia pastoris system. Biotechnol. Lett. 39, 1149-1157 (2017).
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使用疫苗靶標對小鼠進(jìn)行免疫反應，篩選血清的抗病毒活性，并優(yōu)化有前景的候選對象
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Takara Bio的SMARTer Mouse BCR IgG H/K/L Profiling Kit和SMARTer Mouse TCR a/b Profiling Kit可用于通過(guò)監測BCR和TCR克隆型的多樣性變化，加快針對目標疫苗的抗病毒活性的免疫血清篩選過(guò)程。通過(guò)分析和比較接種動(dòng)物在感染病毒之前和之后的抗體和T細胞反應，進(jìn)一步優(yōu)化了有前景的候選疫苗。
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SMARTer Mouse BCR IgG H/K/L Profiling Kit
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· 支持10 ng-3 μg來(lái)自于脾臟、淋巴結、PBMCs 及雜交瘤的總RNA起始
· 在大多數情況下，可以有效擴增并通過(guò)測序鑒別小鼠IgG亞類(lèi)
· 可以高靈敏度地從同一樣品中檢測不同鏈
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SMARTer Mouse TCR a/b Profiling Kit
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· 支持10 ng 至500 ng的來(lái)源于小鼠脾臟、胸腺或PBMCs的總RNA起始，也可以1,000 至 10,000個(gè)純化的T細胞起始
· 可獲得TCR mRNA轉錄本可變區的全長(cháng)序列
· 可同時(shí)或單獨分析TCR兩個(gè)亞基的多樣性
· 無(wú)需多重PCR，每次反應利用一對引物擴增相應的TCR亞基
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評估選定的最終候選疫苗在臨床試驗中的有效性
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監測免疫反應是評估最終候選疫苗有效性的關(guān)鍵。通過(guò)NGS對BCR和TCR進(jìn)行序列分析，可以正確監測克隆型的變化，并識別疫苗特異性的克隆型。
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【產(chǎn)品一覽表】
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Code No.
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產(chǎn)品名稱(chēng)
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包裝量
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新一代測序相關(guān)
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表達和純化相關(guān)
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克隆相關(guān)
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