RNA scope實(shí)驗方法
2021-09-01文章來(lái)源：知乎
RNA scope實(shí)驗方法（參考ACD說(shuō)明書(shū)官網(wǎng)）
實(shí)驗原理：
RNAscope®是一項新穎的用于檢測位于完整細胞中目標RNA的原位雜交（In Situ Hybridization，ISH)檢測技術(shù)。該技術(shù)以其能放大特異性信號而非噪音信號的專(zhuān)利探針設計方法。RNA原位雜交是基于反義RNA與靶基因RNA的堿基配對原理，利用地高辛標記的反義RNA為探針，與切片雜交，從而原位顯示RNA的表達部位和相對豐度。RNA原位雜交是研究基因表達譜的重要方法。
RNAscope®獨特的雙Z (ZZ) 探針設計有效的防止了探針的非特異性結合，同時(shí)降低了背景干擾。由于結合在非特異性位點(diǎn)的單個(gè)的Z探針不會(huì )產(chǎn)生完整的信號放大分子結合位點(diǎn)，并會(huì )在雜交過(guò)程中被洗脫掉，從而防止非特異性信號的放大，使得探針的信號具有高度特異性。雙Z探針即可在標準的顯微鏡下呈現可觀(guān)察到的點(diǎn)狀信號。
實(shí)驗步驟（冰凍組織切片樣本）：
1. 組織切片前，在 –20° C 平衡組織塊，時(shí)長(cháng)為至少 1 小時(shí)。
2. 用冰凍切片機將包埋好的組織切成 7-15μm（15μm） 的切片。將切片粘附在 SUPERFROST ® Plus 載玻片上。為獲得最佳染色，按如圖所示放置組織：
3. 在 –20° C 下放置 20 分鐘干燥切片。如果不立即使用該切片，則在 -80℃保存。
4. 載玻片置于 Tissue-Tek ® 載玻片架，用 200mL 1× PBS 中清洗載玻片 5 分鐘，上下移動(dòng)載玻片架以清洗去除 OCT。
準備預處理所需材料和儀器
1. 打開(kāi) HybEZ? 雜交爐，將溫度設置為 40° C。
2. 將一張吸水紙放入濕盒內中 (50 ml)，并用蒸餾水將其徹底浸濕。
3. 蓋上蓋，將濕盒放入雜交爐，關(guān)閉爐門(mén)。在 40° C 下預熱 30 分鐘。
4. 向燒杯中倒入 1 瓶（70mL）10× 靶標修復試劑，然后加入 630mL 蒸餾水，混合制備得到 700mL RNAscope ® 1× 靶標修復試劑。用錫箔紙覆蓋燒杯，將燒杯放在熱板上。將加熱板調至高檔，加熱 10-15分鐘 (15分鐘) 至 1× 靶標修復試劑達到緩慢沸騰狀態(tài)（98-102℃）后，將熱板調至低檔，以維持緩慢沸騰狀態(tài)。使用前煮沸不超過(guò) 30 分鐘。
RNAscope ® 雙氧水處理
RNAscope ® 靶標修復試劑處理畫(huà)疏水圈
1. 將載玻片放置在 HybEZ? 載玻片架上，滴加約 5-8 滴 RNAscope ®雙氧水，使其覆蓋樣本。
2. 室溫下孵育載玻片 10 分鐘。
3. 在吸水紙上輕敲和 / 或輕彈載玻片，去除載玻片上的 RNAscope ® 雙氧水，立即將載玻片插入浸沒(méi)于裝滿(mǎn)蒸餾水的 Tissue-Tek ® 清洗皿中的 Tissue-Tek ® 載玻片架上。
4. 上下移動(dòng) Tissue-Tek ® 載玻片架，清洗載玻片 3-5 次（3次/3 分鐘）。
雙氧水處理的目的，一種強氧化劑，通透細胞的作用，使細胞的RNA充分暴露出來(lái)。
RNAscope ® 靶標修復試劑處理
1. 用鑷子將 Tissue-Tek ® 載玻片架 非常緩慢 地浸沒(méi)在 1× 靶標修復試劑中，5 分鐘。
2. 用鑷子立即將熱載玻片架從 1× 靶標修復試劑中轉移至盛有蒸餾水的染色皿中。請勿在 1× 靶標修復試劑中冷卻載玻片。
3. 上下移動(dòng) Tissue-Tek ® 載玻片架，清洗載玻片 3次/5分鐘。
4. 將載玻片轉移至 100% 乙醇，孵育 3 分鐘。
5. 室溫下完全干燥載玻片。
畫(huà)疏水圈
1. 使用 Immedge? 疏水筆按照以下模板在每張切片周?chē)?huà)疏水圈 2-4 次。
重要！不要讓疏水圈接觸組織切片。強烈推薦使用 Immedge? 疏水筆。其它疏水筆可能無(wú)法達到最理想的效果。
RNAscope ® 蛋白酶 III 處理
1. 將載玻片置于 EZ-Batch? 載玻片夾上，滴加約 5 滴 RNAscope ®蛋白酶 III 試劑，以完全覆蓋切片。
2. 從 HybEZ? 雜交爐中取出 HybEZ ? 濕盒，將載玻片夾放入盒中。蓋上蓋，將放入雜交爐，40攝氏度， 30分鐘。
4. 從雜交爐取出 HybEZ? 濕盒。從盒中取出 EZ-Batch ? 載玻片夾。
5. 立即將 EZ-Batch? 載玻片夾放入盛有蒸餾水的 EZ-Batch ? 清洗槽中。不時(shí)地晃動(dòng) EZ-Batch ? 清洗槽，清洗載玻片 3-5 次。
6. 使用新鮮的蒸餾水重復步驟 5。
RNAscope ® 多通道二代熒光檢測
準備材料
制備 1× 清洗緩沖液
1. 將 RNAscope ® 50× 清洗緩沖液在 40° C 下預熱 10-20 分鐘。
2. 將 5.88 L 蒸餾水和 2 瓶（120 mL） RNAscope ® 清洗緩沖液（50×）加入大玻璃瓶中，充分混合，配制成 6 L 的 1× 清洗緩沖液。
準備探針
1. 在水浴箱或孵育箱中，40° C 預熱探針至少 10 分鐘，然后冷卻至室溫（RT）。
2. 快速離心將 C2 和 C3 探針液體收集在探針管底部。
3. 根據用量需求，取 1 體積 C2 、1 體積 C3 探針和 50 體積 C1 探針混合備用。
平衡試劑
1. 從冰箱中取出 AMP 1、AMP2、AMP3、 HRP-C1、HRP-C2、HRP-C3 和 HRP 阻斷劑，置于室溫下。
2. 確保 HybEZ? 雜交爐和濕盒維持 40° C。
3. 150 mL 蒸餾水加 50 mL 20X SSC，充分混合，制備得到 200 mL 5X SSC。
探針雜交
1. 去除 EZ-Batch? 載玻片夾中的載玻片上多余的液體，滴加 4-6 滴探針混合物，完全覆蓋樣本。
2. 將 EZ-Batch? 載玻片夾放入 HybEZ ? 濕盒，蓋上蓋，放入 HybEZ ? 雜交爐。在 40° C 下孵育 2 小時(shí)。
3. 取出載玻片夾，立即將其放入盛有新鮮 RNAscope ® 1× 清洗緩沖液的 EZ-Batch? 清洗槽中。不時(shí)地晃動(dòng)清洗槽，在室溫下清洗載玻片 2 分鐘/ 2次。
雜交 AMP1
1. 從 5× SSC 中取出載玻片，并使用新鮮 RNAscope ® 1× 清洗緩沖液清洗載玻片 1-2 次。
2. 去除載玻片上多余的液體，滴加 4-6 滴 RNAscope ® 多通道二代熒光 AMP1，完全覆蓋樣本。
3. 將載玻片夾放入濕盒，蓋上蓋，放入雜交爐。在 40° C 下孵育 30 分鐘。
4. 取出載玻片夾，立即將其放入盛有新鮮 RNAscope ® 1× 清洗緩沖液的 EZ-Batch? 清洗槽中。不時(shí)地晃動(dòng)清洗槽，在室溫下清洗載玻片 2 分鐘/2次。
雜交 AMP2
1. 去除載玻片上多余的液體，滴加 4-6 滴 RNAscope ® 多通道二代熒光 AMP2，完全覆蓋樣本。
2. 將載玻片夾放入濕盒，蓋上蓋，放入雜交爐。在 40° C 下孵育 30 分鐘。
3. 取出載玻片夾，立即將其放入盛有新鮮 RNAscope ® 1× 清洗緩沖液的清洗槽中。不時(shí)地晃動(dòng)清洗槽，在室溫下清洗載玻片 2 分鐘/2次。
雜交AMP3
1. 去除載玻片上多余的液體，滴加 4-6 滴 RNAscope ® 多通道二代熒光 AMP3，完全覆蓋樣本。
2. 將載玻片夾放入濕盒，蓋上蓋，放入雜交爐。在 40° C 下孵育 15 分鐘。
重要！ 在進(jìn)行這一步驟期間，準備 TSA ® Plus 熒光染料。參考后續步驟。
3. 取出載玻片夾，立即將其放入盛有新鮮 RNAscope ® 1× 清洗緩沖液的清洗槽中。不時(shí)地晃動(dòng)清洗槽，在室溫下清洗載玻片 2 分鐘/2次。
（無(wú)論同時(shí)檢測幾個(gè) RNA 靶標，雜交 AMP1、AMP2 和 AMP3 的步驟都需要全部完成）
C1 通道探針的信號標記
1. 根據 Perkin Elmer 公司的 TSA ® Plus 熒光染料說(shuō)明書(shū)，配置 TSA ® Plus FITC、TSA ® Plus Cy3 和 TSA ®Plus Cy5 熒光染料儲備液。
2. 確定本次實(shí)驗所需 TSA ® Plus 熒光染料的體積（每張載玻片 150-200 μL）。
3. 用 RNAscope ® 多通道二代熒光試劑盒提供的 TSA 緩沖液稀釋 TSA ® Plus 熒光染料。
4.去除載玻片上多余的液體，滴加150-200 μL 稀釋的TSA ® Plus FITC，完全覆蓋樣本。將載玻片夾放入濕盒，蓋上蓋，放入雜交爐。在 40° C 下孵育 30 分鐘。
5. 用新鮮 RNAscope ® 1× 清洗緩沖液洗滌載玻片，在室溫下洗滌 2 分鐘。用新鮮 RNAscope ® 1× 清洗緩沖液重復此步驟。
6. 去除載玻片上多余的液體，滴加 4-6 滴 RNAscope ® 多通道二代熒光 HRP 阻斷劑，完全覆蓋樣本。
7. 將載玻片夾放入濕盒，蓋上蓋，放入雜交爐。在 40° C 下孵育 15 分鐘。
8. 取出載玻片夾，立即將其放入盛有新鮮 RNAscope ® 1× 清洗緩沖液的清洗槽中。不時(shí)地晃動(dòng)清洗槽，在室溫下清洗載玻片 2 分鐘。用新鮮 RNAscope ® 1× 清洗緩沖液重復 1 次。
與其共染的免疫熒光染色技術(shù)（實(shí)驗方法版權歸廖師姐所有）
試劑：1*TBS：6.057 g Tris base, 8.7668 g NaCl to 1 L distilled water. PH 7.6.
TBST wash buffer: 500 ul 10% Tween 20+1L 1*TBS buffer.
TBS-10% BSA (BSA, Fraction V(ST023-50g), Beyotime) : 1g BSA to 100 ml 1*TBS.
方法：1. Wash slides 2 times/ 2 min in TBST wash buffer 輕柔攪動(dòng)。
2. 10% 正常血清（山羊血清） in 1% BSA（TBS稀釋?zhuān)?for 30 min at RT, or overnight at 4 ℃
3. 去除多余的封閉液（勿洗）
4. 一抗溶液稀釋在1%BSA（TBS稀釋?zhuān)┲?，滴加與組織中45min，2h。RT/4℃，過(guò)夜。
5. TBST洗滌RT, 2次，5min
6. TBS-1%BSA 稀釋2抗，2h。RT
7. 滴加DAPI 30s，去除DAPI后，封片。
