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一步法RT-qPCR快速篩查新冠病毒
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多人死亡，往返中國的航班取消，潛在接觸者被隔離，促使世界衛生組織（WHO）宣布新型冠狀病毒（2019-nCoV）疫情被劃入“國際關(guān)注的突發(fā)公共衛生事件”（PHEIC）。截至2020年2月10日，2019-nCoV引發(fā)的呼吸道疾病已導致全球1000余人死亡，4萬(wàn)余人確診患病。
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冠狀病毒是一類(lèi)能引起上呼吸道和下呼吸道疾病的病毒，具有類(lèi)似太陽(yáng)冠冕的特征性尖刺外觀(guān)。許多常見(jiàn)的冠狀病毒通常會(huì )導致輕度到中度的癥狀，但有些病毒會(huì )導致嚴重的癥狀，并可能發(fā)展為致命的肺炎，比如在2003年爆發(fā)的SARS-CoV 和2015年的MERS-CoV。由于2019-nCoV引發(fā)的肺炎導致多人死亡，且可能潛在的無(wú)癥狀個(gè)體傳播，因此，對該病毒進(jìn)行有效的實(shí)驗室篩查對控制此次疫情至關(guān)重要。
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2020年1月24日，中國疾病預防控制中心等權威機構發(fā)布了鑒定2019-nCoV的文獻《A Novel Coronavirus from Patients with Pneumonia in China, 2019》。文章中，作者開(kāi)發(fā)了一種病毒篩選方法，通過(guò)RNA-Seq技術(shù)獲得了特異性病毒序列，對2019-nCoV進(jìn)行測序和分類(lèi)，還使用光鏡和透射電鏡觀(guān)察了2019-nCoV感染的人呼吸道上皮細胞中培養物的病毒顆粒和細胞病變效應。這其中使用了Takara探針?lè )?a style="margin:0px;padding:0px;list-style-type:none;outline:none;border:none;text-decoration-line:none;color:#000000;">One Step PrimeScript? RT-PCR Kit (Perfect Real Time)（Code No. RR064）。
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中國科學(xué)院武漢病毒研究所發(fā)表的文章《Discovery of a novel coronavirus associated with the recent pneumonia outbreak in humans and its potential bat origin》，已經(jīng)鑒定出該病毒在整個(gè)基因組水平上與蝙蝠冠狀病毒96%相同，對7種保守的非結構蛋白的成對序列分析表明，該病毒屬于SARSr-CoV。重要的是，他們證實(shí)2019-nCoV使用了與SARS冠狀病毒相同的細胞進(jìn)入受體ACE2。該團隊使用了Takara的SMARTer RACE 5'/3' Kit（Code No. 634858） 用于確定病毒基因組的5'末端序列。
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另一個(gè)研究小組（Letko和Munster 2020）利用Takara高效率無(wú)縫克隆技術(shù)In-Fusion HD Cloning Kit（Code No. 639648）克隆了該病毒的刺突編碼序列，研究了2019-nCoV的細胞進(jìn)入機制。
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類(lèi)似的方法已經(jīng)被許多組織用來(lái)識別這種特殊病毒的其他部分。中國疾病預防控制中心推薦了One Step PrimeScript? RT-PCR Kit (Perfect Real Time)（Code No. RR064）用于2019-nCoV的檢測，并已經(jīng)在中國各地被廣泛使用。世界衛生組織（WHO）和疾病預防控制中心（CDC）已經(jīng)開(kāi)發(fā)出類(lèi)似的方法，隨著(zhù)更多病例的報道，WHO將對病毒檢測方法提出更多建議。
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我們正迅速行動(dòng)，以滿(mǎn)足中國以及其他國家不斷增加的2019-nCoV篩查需求。
Takara 愿以高質(zhì)量的產(chǎn)品和熱忱的服務(wù)，為2019-nCoV篩查貢獻綿薄之力。
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山川異域，風(fēng)月同天。守望相助，眾志成城。
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Takara提供2019-nCoV篩查完整解決方案
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產(chǎn)品
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Code No.
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包裝量
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用途
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DNA-OFF?
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9036
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500 ml
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去除實(shí)驗區域DNA污染
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RNase-OFF?
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9037
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500 ml
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去除RNase污染
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TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0
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9766
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50 次
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柱式法病毒核酸提取
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RNAiso Plus
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9108/9109
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100/200 ml
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試劑型Total RNA提取
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One Step PrimeScript? RT-PCR Kit (Perfect Real Time)
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RR064A/B
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100/500 次 （50 μl反應）
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probe法One Step RT-qPCR
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PrimeDirect? Probe RT-qPCR Mix
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RR650A/B
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200/1,000 次（25 μl反應）
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無(wú)需RNA純化，直接進(jìn)行probe法One Step RT-qPCR
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PrimeDirect? Probe RT-qPCR Mix, with UNG
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RR651A/B
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200/1,000 次（25 μl反應）
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RR650的UNG版本，防止假陽(yáng)性
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One Step PrimeScript? III RT-qPCR Mix
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RR600A/B
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200/1,000 次（25 μl反應）
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完全premix型probe法One Step RT-qPCR
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One Step PrimeScript? III RT-qPCR Mix, with UNG
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RR601A/B
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200/1,000 次（25 μl反應）
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RR600的UNG版本，防止假陽(yáng)性
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Uracil DNA Glycosylase (UNG), heat-labile
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2820
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200 U
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防止Carryover污染導致的假陽(yáng)性
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dU plus dNTP Mixture (12.5×)
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4035
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800 μl
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防止Carryover污染導致的假陽(yáng)性
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dNTP Mixture
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4030
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各3.2 μmol/1.28 ml
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PCR底物
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dNTP Mixture
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4019
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各2.5 μmol/250 μl
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PCR底物
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Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H-)
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2641A/B
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10,000/40,000 U
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反轉錄酶
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Recombinant RNase Inhibitor
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2313A/B
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5,000/25,000 U
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RNase抑制劑
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T7 RNA Polymerase
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2540A/B
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5,000 U/25,000 U
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RNA標準品的體外轉錄
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RNase-free Water
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9012
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1 ml×10 支
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RNA實(shí)驗用水
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除上述目錄產(chǎn)品外，Takara不斷完善病毒檢測方案，提供WHO、中國疾病預防控制中心公布指導的引物探針套裝、美國疾病控制與預防中心公布指導的引物探針套裝。
同時(shí)，引物探針套裝中還增加了所有檢測靶點(diǎn)Control RNA產(chǎn)品。
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一、新型冠狀病毒（2019-nCoV）ORF1ab基因、E蛋白基因、N蛋白基因檢測套裝：
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序號
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Primer/Probe名稱(chēng)*
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堿基序列 (方向為5' to 3')*
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5'修飾
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3'修飾
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Control RNA**
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01
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2019-nCoV RdRP_SARSr-F2
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GTG ARA TGG TCA TGT GTG GCG G
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Ger-RdRP
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02
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2019-nCoV RdRP_SARSr-R1
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CAR ATG TTA AAS ACA CTA TTA GCA TA
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03
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2019-nCoV RdRP_SARSr-P2
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CAG GTG GAA CCT CAT CAG GAG ATG C
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FAM
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BHQ-1
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04
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2019-nCoV RdRP_SARSr-P1
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CCA GGT GGW ACR TCA TCM GGT GAT GC
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FAM
|
BHQ-1
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05
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2019-nCoV E_Sardeco-F1
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ACA GGT ACG TTA ATA GTT AAT AGC GT
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Ger-E
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06
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2019-nCoV E_Sardeco-R2
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ATA TTG CAG CAG TAC GCA CAC A
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07
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2019-nCoV E_Sardeco-P1
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ACA CTA GCC ATC CTT ACT GCG CTT CG
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FAM
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BHQ-1
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08
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2019-nCoV N_Sarbeco_F1
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CAC ATT GGC ACC CGC AAT C
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Ger-N
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09
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2019-nCoV N_Sarbeco_R1
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GAG GAA CGA GAA GAG GCT TG
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10
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2019-nCoV N_Sarbeco_P1
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ACT TCC TCA AGG AAC AAC ATT GCC A
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FAM
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BHQ-1
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二、新型冠狀病毒（2019-nCoV）ORF1ab/N基因檢測套裝：
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序號
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Primer/Probe名稱(chēng)*
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堿基序列 (方向為5' to 3')*
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5'修飾
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3'修飾
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Control RNA**
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11
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2019-nCoV nsp14F
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TGG GGY TTT ACR GGT AAC CT
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HK-ab1
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12
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2019-nCoV nsp14R
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AAC RCG CTT AAC AAA GCA CTC
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13
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2019-nCoV nsp14P
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TAG TTG TGA TGC WAT CAT GAC TAG
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FAM
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TAMRA
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14
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2019-nCoV NF
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TAA TCA GAC AAG GAA CTG ATT A
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HK-N
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15
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2019-nCoV NR
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CGA AGG TGT GAC TTC CAT G
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16
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2019-nCoV NP
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GCA AAT TGT GCA ATT TGC GG
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FAM
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TAMRA
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根據中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所公布指導，Takara提供一個(gè)qPCR引物探針套裝：
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序號
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Primer/Probe名稱(chēng)*
|
堿基序列 (方向為5' to 3')*
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5'修飾
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3'修飾
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Control RNA**
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17
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CDC 2019-nCoV ORF1ab-F
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CCCTGTGGGTTTTACACTTAA
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CDC-ORF1ab
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18
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CDC 2019-nCoV ORF1ab-R
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ACGATTGTGCATCAGCTGA
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19
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CDC 2019-nCoV ORF1ab-P
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CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG
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FAM
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BHQ-1
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20
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CDC 2019-nCoV N-F
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GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT
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CDC-N
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21
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CDC 2019-nCoV N-R
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CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG
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22
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CDC 2019-nCoV N-P
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TTGCTGCTGCTTGACAGATT
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FAM
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TAMRA
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根據美國疾病控制與預防中心公布指導，Takara提供一個(gè)qPCR引物探針套裝：
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序號
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Primer/Probe名稱(chēng)*
|
堿基序列 (方向為5' to 3')*
|
5'修飾
|
3'修飾
|
Control RNA**
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23
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US CDC 2019-nCoV_N1-F
|
GACCCCAAAATCAGCGAAAT
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US-N1
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24
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US CDC 2019-nCoV_N1-R
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TCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG
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25
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US CDC 2019-nCoV_N1-P
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ACCCCGCATTACGTTTGGTGGACC
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FAM
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BHQ-1
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26
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US CDC 2019-nCoV_N2-F
|
TTACAAACATTGGCCGCAAA
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US-N2
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27
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US CDC 2019-nCoV_N2-R
|
GCGCGACATTCCGAAGAA
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28
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US CDC 2019-nCoV_N2-P
|
ACAATTTGCCCCCAGCGCTTCAG
|
FAM
|
BHQ-1
|
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29
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US CDC 2019-nCoV_N3-F
|
GGGAGCCTTGAATACACCAAAA
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US-N3
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30
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US CDC 2019-nCoV_N3-R
|
TGTAGCACGATTGCAGCATTG
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31
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US CDC 2019-nCoV_N3-P
|
AYCACATTGGCACCCGCAATCCTG
|
FAM
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BHQ-1
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32
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US CDC RP-F（內參檢測用）
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AGATTTGGACCTGCGAGCG
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33
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US CDC RP-R（內參檢測用）
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GAGCGGCTGTCTCCACAAGT
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34
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US CDC RP-P（內參檢測用）
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TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG
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FAM
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BHQ-1
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*所有引物探針為HPLC純化級別，客戶(hù)可以根據需要選擇合適的套裝。
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**Control RNA產(chǎn)品需單獨訂購，訂購時(shí)請咨詢(xún)各地代理商。
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Takara還可以提供使用簡(jiǎn)便、性?xún)r(jià)比高、可靠的Real Time PCR儀Thermal Cycler Dice Real Time System III (Code No. TP950)。 除具有以往Takara PCR儀受到好評的友好操作軟件外，還搭載觸摸屏控制面板，可進(jìn)行單機 (獨立) 操作，以追求操作簡(jiǎn)便性。
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特點(diǎn)介紹：
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◇ 搭載觸摸屏，可獨立操作，支持英語(yǔ)/日語(yǔ)界面，儀器軟件更加追求操作簡(jiǎn)便性。
◇ 可做高速定量PCR反應。
使用嵌合熒光染料檢測法時(shí)，與試劑TB Green Fast qPCR Mix（Code No. RR430）搭配使用，TP950可完成快速定量PCR反應。
◇ 專(zhuān)為科研用戶(hù)設計的便于操作的定量軟件。
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