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傳統的免疫分析法應用于蛋白質(zhì)藥物檢測，具有靈敏度高特異性強的優(yōu)點(diǎn)，但也有不足，例如線(xiàn)性范圍窄、基質(zhì)干擾以及相對較長(cháng)的方法開(kāi)發(fā)周期（可能需要2-3個(gè)月）等。

近年來(lái)，隨著(zhù)LC-MS/MS技術(shù)在蛋白質(zhì)類(lèi)藥物生物分析領(lǐng)域的應用，已可將方法開(kāi)發(fā)周期縮短為1周，同時(shí)該技術(shù)還具備專(zhuān)屬性強、線(xiàn)性范圍較寬、精密度及準確度高和功能豐富等優(yōu)點(diǎn)。以對血漿中蛋白質(zhì)類(lèi)藥物進(jìn)行LC-MS/MS檢測為例，一般使用的生物分析方法流程大致如下：

方法開(kāi)發(fā)

分析過(guò)程

在上述研究流程中，大規模目的蛋白質(zhì)的富集和蛋白質(zhì)樣品消化通常是限速步驟，Takara公司的Capturem?技術(shù)一改傳統設計，創(chuàng )新性運用多孔薄膜作為基質(zhì)偶聯(lián)相應的配基，在高通量（96 well）樣品處理時(shí)僅需15 min即可完成，刷新了人們對質(zhì)譜樣品處理步驟的一貫認知，為藥物研發(fā)過(guò)程中的DMPK檢測提供高通量、快速的解決方案！

目的蛋白質(zhì)的富集

Protein A和Protein G是細菌的胞壁蛋白質(zhì)，能夠特異性的與IgG的Fc片段結合。這一結合非常牢固，但其結合力卻受pH的影響，抗體-protein A/protein G的親和力會(huì )隨著(zhù)pH值的降低而急劇降低，應用protein A和protein G親和純化抗體就是基于此原理。

市售的傳統產(chǎn)品包括偶聯(lián)有protein A或protein G的凝膠樹(shù)脂或磁珠，純化抗體時(shí)，將樣品與純化介質(zhì)混合或上柱孵育，之后進(jìn)行常規的洗滌和純化步驟分離得到抗體，再進(jìn)行酶解消化處理和LC-MS/MS分析，這也是從事制備或下游工藝放大的研究人員比較常規的選擇。但是對于從事抗體藥物DMPK研究的工作人員來(lái)說(shuō)，面臨的是樣品量小，但數量龐大的嚴峻挑戰，常規樹(shù)脂純化方法預處理和純化時(shí)間長(cháng)，柱床體積大，并且對操作環(huán)境和操作設備都有較高要求，不便于開(kāi)展大規模低量樣品的篩選和驗證性實(shí)驗，即使是選擇操作較為簡(jiǎn)便、耗時(shí)較短的磁珠純化法，也難以避免實(shí)驗前要對磁珠進(jìn)行分裝、預處理，實(shí)驗中要進(jìn)行的孵育以及頻繁的移液操作，在進(jìn)行高通量實(shí)驗時(shí)，人力和時(shí)間仍是捉襟見(jiàn)肘！

Takara公司獨家提供應用新型膜技術(shù)的Capturem? protein A 96 well和Capturem? protein G 96 well高通量抗體快速純化板，為從事抗體藥物DMPK的研發(fā)人員提供新思路和新方法！

技術(shù)原理：

“Capturem”是“Capture”和“membrane”兩個(gè)詞的巧妙組合，即“具有捕獲能力的膜”。Capturem?膜技術(shù)的基本原理與傳統樹(shù)脂是相同的，都是通過(guò)protein A或protein G與抗體的親和作用實(shí)現分離純化，不同的是基質(zhì)的設計，傳統的樹(shù)脂將配基偶聯(lián)于瓊脂糖凝膠，而Capturem?膜技術(shù)是將配基固定在具有多孔結構的膜上，通過(guò)對膜的改造，使其內表面積增大，能夠固定更多的配基，因而對目的蛋白質(zhì)/抗體具有更強的結合能力，相當于或高于75 mg/cm³樹(shù)脂。

產(chǎn)品特點(diǎn)及主要參數

? 操作簡(jiǎn)單，室溫下離心機操作即可
? 速度快，純化操作從上樣到洗脫結束僅需15 min即可完成
? 通量高，一次性可完成96 well的樣品純化
? 均一性好，純化結果呈良好的線(xiàn)性關(guān)系

  

注：96 well 規格的產(chǎn)品需要96孔板使用的離心機或真空過(guò)濾裝置。

實(shí)驗例

Capturem?膜技術(shù)把純化介質(zhì)由一定體積的樹(shù)脂變成一層薄膜，大大的壓縮了柱床體積，樣品可快速通過(guò)介質(zhì)，降低了變性和擴散的風(fēng)險。等體積的洗滌液對膜的洗滌效果更加徹底，并可實(shí)現高濃度、高純度洗脫。下圖是以人血清樣品為例，對比Capturem?膜技術(shù)和傳統樹(shù)脂方法的純化效果，結果顯示，Capturem?膜技術(shù)純化產(chǎn)物中的雜質(zhì)白蛋白（Albumin）含量更低，這大大降低了后續酶解消化、LC分離和質(zhì)譜分析的負擔。

注：由于protein A和protein G對于不同類(lèi)型的抗體結合能力存在差異，因此需要根據目標抗體的性質(zhì)進(jìn)行選擇。除了抗體純化，Takara公司還提供用于his-tag重組蛋白質(zhì)高通量快速純化的Capturem?產(chǎn)品（Code No. 635714），請查詢(xún)官網(wǎng)www.takarabiomed.com.cn了解詳情。

樣品蛋白質(zhì)的酶解消化

為了獲得樣品中待測蛋白質(zhì)的信號肽，需要使用蛋白酶（如胰蛋白酶）對樣品進(jìn)行消化，將其中的蛋白質(zhì)分解成為多肽。蛋白酶消化的一般過(guò)程包括使用尿素或鹽酸胍對蛋白質(zhì)進(jìn)行變性處理、使用二硫蘇糖醇（DTT）對蛋白質(zhì)進(jìn)行還原處理、再使用碘乙酰胺（IAA）對變性還原成為一級結構的蛋白質(zhì)進(jìn)行烷基化處理，最后加入酶孵育。其中酶解過(guò)程的成功與否對接下來(lái)的LC-MS/MS分析非常重要，因為產(chǎn)生的信號肽的多少以及長(cháng)短會(huì )直接影響到檢測方法的準確性和靈敏度。傳統的酶解方法是溶液法，即將樣品與一定濃度的胰蛋白酶混合，在37℃進(jìn)行數小時(shí)甚至過(guò)夜的孵育。這種方法操作簡(jiǎn)單，成本低，但是可能會(huì )存在胰蛋白酶自身降解或對目的蛋白質(zhì)過(guò)度消化的問(wèn)題，并且耗時(shí)較長(cháng)，容易成為整個(gè)質(zhì)譜分析的限速步驟。

Takara公司獨家提供Capturem? Trypsin Miniprep Kit和Capturem? Pepsin Miniprep Kit一次性小型離心柱試劑盒，應用Capturem?新型膜技術(shù)，膜上固定的是胰蛋白酶（Trypsin）或胃蛋白酶（Pepsin），與傳統的溶液法過(guò)夜處理相比，具有以下優(yōu)勢：

? 操作快速，2 min-3 min內即可酶解蛋白質(zhì)樣品，無(wú)需過(guò)夜處理
? 比溶液法效率更高，酶解更徹底，但又能避免過(guò)度消化
? 樣品中蛋白酶自身降解片段更少，蛋白質(zhì)非特異性修飾幾率更低
? 可以使整個(gè)蛋白質(zhì)組學(xué)分析流程更加連貫，實(shí)現更有效的肽和蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定

實(shí)驗例

使用Capturem?膜技術(shù)的酶解消化操作可明顯提高工作效率、節約時(shí)間成本，使整個(gè)LC-MS/MS檢測流程更加流暢，以Capturem? Trypsin為例對比其與溶液法的效率差別如下：

使用Capturem? Trypsin可以實(shí)現快速完全的Apomyoglobin（Apo）酶解。上圖為使用RP-HPLC分析Capturem? Trypsin和常規溶液法酶解蛋白質(zhì)的結果，圖A為未酶解的完整蛋白質(zhì)，圖B為溶液法室溫酶解16 h的蛋白質(zhì)，圖C為使用Capturem? Trypsin酶解1 min的蛋白質(zhì)，結果顯示使用Capturem? Trypsin的酶解非常徹底。

抗體藥物DMPK研究樣本量龐大，所以選擇準確性高、重復性好的方法對于獲得真實(shí)可靠的實(shí)驗數據是至關(guān)重要的。以Capturem? Typsin為例，選擇不同批次的產(chǎn)品驗證其穩定性和重復性，結果顯示，Capturem?技術(shù)可以滿(mǎn)足DMPK研究中數量龐大的樣品對酶解消化處理穩定性和重復性的要求，是實(shí)現高通量和自動(dòng)化檢測的必要前提。

不同批次的Capturem? Trypsin消化產(chǎn)物HPLC圖譜比較。使用80 μg的Apo，選擇3個(gè)不同批次的Capturem? Trypsin在天然條件下對其進(jìn)行消化，HPLC結果顯示三組消化產(chǎn)物具有相同的片段，說(shuō)明Capturem? Trypsin具有良好的重復性。

酶的自身降解以及對目標蛋白質(zhì)的過(guò)度消化是溶液法處理樣品時(shí)常會(huì )遇到的問(wèn)題。酶的自身降解會(huì )導致圖譜中出現不同程度的高強度胰蛋白酶自身降解峰，可能會(huì )減弱目標肽段峰的強度，在二級質(zhì)譜鑒定時(shí)無(wú)法獲得較好的離子碎片圖譜；對目標蛋白質(zhì)的過(guò)度消化會(huì )產(chǎn)生過(guò)多的小肽段，降低信號肽的特異性，影響最終的檢測和分析結果。而Capturem?技術(shù)因其膜結構的設計，有著(zhù)處理時(shí)間短、酶與樣品接觸充分的優(yōu)勢，所得到的肽段更長(cháng)，特異性更好，并且分布均勻，色譜峰沒(méi)有過(guò)度重疊的現象。
 

Capturem? Pepsin與pepsin溶液法消化結果比較。對50 μg 的anti-HER2單克隆抗體（赫賽汀，曲妥珠單抗，人IgG1，κ鏈）使用3種方法進(jìn)行酶解消化，分別是Capturem? Pepsin，pepsin溶液法孵育4小時(shí)，pepsin溶液法孵育過(guò)夜。然后進(jìn)行質(zhì)譜分析。由上圖可以看出，使用溶液法的消化產(chǎn)物峰左移并且總體峰的數量較多，說(shuō)明產(chǎn)生了過(guò)度消化，而使用Capturem? Pepsin則沒(méi)有這個(gè)問(wèn)題。

重要通知：Capturem? 96-well trypsin plate即將上市，可在10 min內進(jìn)行高通量的蛋白質(zhì)酶解消化操作，并且具備良好的孔間重復性，敬請期待！

Capturem?的榮譽(yù)：

榮譽(yù)一
 
在瑞典6月9日舉辦的2016年重組蛋白質(zhì)技術(shù)討論會(huì )上，Takara Bio USA, Inc.新推出的Capturem? Protein A技術(shù)獲得了ELRIG技術(shù)獎。

這個(gè)兩天的會(huì )議集中探討了使用重組蛋白質(zhì)作為生物治療藥物和在藥物研發(fā)試劑方面的最新進(jìn)展。2016年的主題包括宿主-細胞工廠(chǎng)、基因組編輯和蛋白質(zhì)工程。

榮譽(yù)二

2018年6月3日-7日，在第66屆美國質(zhì)譜年會(huì )（ASMS 2018）上，來(lái)自美國默克制藥公司（Merck & Co., Inc.），默克研究所(Merck Research Labs, West Point, PA)藥代動(dòng)力學(xué)及藥效動(dòng)力學(xué)部門(mén)的Dr. Michelle R. Robinson及其團隊在大會(huì )上發(fā)表了名為《Improving the Efficiency of Immunoaffinity Purification and Enzymatic Digestion of Monoclonal Antibodies Using Capturem Technology》的學(xué)術(shù)簡(jiǎn)報。

這篇簡(jiǎn)報中主要介紹了在LC-MS檢測中，應用Capturem?技術(shù)進(jìn)行免疫親和純化和酶消化處理將大大縮短實(shí)驗操作時(shí)間，酶消化步驟由傳統溶液法的4-18 hr縮短成3 min，即使是已經(jīng)快到2 hr的自動(dòng)免疫親和純化操作系統也被Capturem?令人驚訝的5 min輕松超越。除了操作的簡(jiǎn)便以及時(shí)間的顯著(zhù)縮短，在這項實(shí)驗中，Capturem?還能夠顯著(zhù)增加實(shí)驗通量達10-20倍，為藥物高通量篩選和驗證提供了更高效的手段。

榮譽(yù)三

2018年10月17日，Takara Bio USA, Inc.的研發(fā)科學(xué)家Christian Hoppmann博士在第二十一屆Clinical & Pharmaceutical Solutions through Analysis年度研討會(huì )（CPSA USA 2018）上，以他所展示的Capturem?技術(shù)，獲得了大會(huì )創(chuàng )新獎。

CPSA會(huì )議旨在跨越多學(xué)科推動(dòng)創(chuàng )新技術(shù)和解決方案的產(chǎn)生，并提供有關(guān)臨床和藥物分析的最新觀(guān)點(diǎn)和經(jīng)驗，重點(diǎn)關(guān)注當前行業(yè)趨勢和相關(guān)主題。

由此可見(jiàn)，Capturem?膜技術(shù)在生物藥物研發(fā)和生物分析領(lǐng)域的應用，大大縮短了藥物在篩選和DMPK研究階段的實(shí)驗周期，為實(shí)現藥物研發(fā)與疾病“賽跑”提供了可能！