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使用Co-IP方法驗證蛋白質(zhì)相互作用的解決方案

2018-08-29文章來(lái)源：Takarabiomed
使用Co-IP方法驗證蛋白質(zhì)相互作用的解決方案
 
在酵母雜交實(shí)驗中，由于文庫的構建是通過(guò)cDNA片段鏈接到質(zhì)粒上的，所以有時(shí)會(huì )產(chǎn)生2/3移碼突變或者編碼蛋白質(zhì)提前終止的假陽(yáng)性情況。因此，在研究蛋白質(zhì)互作過(guò)程中，酵母雜交篩選出相關(guān)蛋白質(zhì)后，還需用其他方法進(jìn)行驗證，看看目的蛋白質(zhì)和篩選出的文庫蛋白質(zhì)是不是“真愛(ài)”。免疫共沉淀法（Co-IP），是以抗體和抗原之間的專(zhuān)一性作用為基礎的用于確定兩種蛋白質(zhì)在完整細胞內生理性相互作用的有效方法。當細胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細胞內存在的許多蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來(lái)。傳統的Co-IP方法是用預先固化在瓊脂糖珠上的protein A的抗體免疫沉淀A蛋白質(zhì)，那么與A蛋白質(zhì)在體內結合的蛋白質(zhì)B也能一起沉淀下來(lái)，以此來(lái)驗證篩選出的蛋白質(zhì)是否具有相互作用。這一次我們將介紹一種突破性的免疫共沉淀Kit——635721 Capturem? IP&Co-IP,采用特殊工藝將protein A固定在新型Capturem? 膜上，從而大幅度縮短實(shí)驗時(shí)間，并提高純化效果。
 
接下來(lái)我們看一下完成酵母雜交蛋白質(zhì)篩選實(shí)驗后，該如何采用Co-IP方法進(jìn)行驗證。這里我們可以引入標簽蛋白質(zhì)myc或者HA，利用標簽抗體來(lái)進(jìn)行Co-IP實(shí)驗。這兩種標簽蛋白質(zhì)具有良好表征和高免疫反應性，同時(shí)也很容易通過(guò)Western Blotting實(shí)驗進(jìn)行檢測。此外，由于Myc和HA是小標簽，所以通常不會(huì )影響目的蛋白質(zhì)的功能。
 
關(guān)于如何引入myc或者HA標簽，實(shí)際上是非常簡(jiǎn)單的。首先我們來(lái)看一下Clontech Matchmaker酵母雙雜交系統中的BD載體和AD載體：
 
 
這兩種載體在bait序列和文庫序列的插入位點(diǎn)前面，分別有兩個(gè)蛋白質(zhì)標簽基因：c-myc和HA。這樣，我們就可以通過(guò)PCR的方法，合并目的蛋白質(zhì)和抗原標簽蛋白質(zhì)序列：
 
 
將Bait-c-Myc與Library-HA構建到合適的載體上，這里可以選擇Clontech 631604 pCMV-Myc & pCMV-HA Vector Set這款載體套裝。這款載體套裝可以使哺乳動(dòng)物細胞表達標簽融合蛋白質(zhì)，同時(shí)還提供了myc和HA標簽蛋白質(zhì)抗體，方便于后續Co-IP實(shí)驗和WB實(shí)驗。Bait-c-Myc與Library-HA克隆到對應載體上后，將載體轉染到哺乳動(dòng)物細胞表達，之后就可以進(jìn)行Co-IP實(shí)驗了。
 
關(guān)于Co-IP實(shí)驗部分，我們強烈推薦Capturem? IP&Co-IP的方法，我們可以將它與傳統的protein A瓊脂糖珠方法進(jìn)行比較。首先來(lái)看傳統的protein A瓊脂糖珠的方法：
 
 
整個(gè)流程需要接近16-18 h。也就是說(shuō)，僅僅是Co-IP純化的實(shí)驗就要消耗1天的實(shí)驗時(shí)間。而使用我們的新方法Capturem? IP&Co-IP，采用特殊工藝將protein A固定在新型Capturem? 膜上，利用抗體和protein A可以結合在一起的特點(diǎn)，從而實(shí)現抗體-互作蛋白質(zhì)復合物的純化。我們來(lái)看一下具體操作流程：
 
 
我們從流程圖中可以看到，抗體和蛋白質(zhì)裂解液孵育需要10 min，每個(gè)柱子最多可加入800 μl包含抗原抗體復合物的樣品，然后用100 μl wash buffer洗滌， 30-50 μl elution buffer洗脫。每個(gè)步驟之間僅需1,000×g離心1 min，樣品與抗體孵育后，從上樣到洗脫純化，僅需5 min，宛如魔法一般神奇！由于樣品在Capturem?膜上停留的時(shí)間短，所以可以很大程度的避免了復合物的凝集、解體或失活，從而提高純化實(shí)驗的成功率。
 
上面的Co-IP實(shí)驗是基于哺乳動(dòng)物細胞表達融合蛋白質(zhì)完成的，如果是植物蛋白質(zhì)做Co-IP，就需要用到另一種方案：
 
 
 
可以說(shuō)，Co-IP部分的實(shí)驗流程和前面是一樣的，區別在于植物蛋白質(zhì)的Co-IP需要用植物蛋白質(zhì)表達載體（可以選擇使用Takara Code No. 3261 pRI 910 DNA）表達標簽融合蛋白質(zhì)。由于植物基因的導入過(guò)程相對來(lái)講稍微繁瑣，需要用到農桿菌轉化法將重組質(zhì)粒在煙草或者擬南芥等模式植物中進(jìn)行表達。
 
以上就是Co-IP方法對互作蛋白質(zhì)進(jìn)行驗證的實(shí)驗方法，如果有誘餌或捕獲蛋白質(zhì)的抗體，那就可以直接用Capturem? IP&Co-IP中的細胞裂解液裂解細胞，之后與抗體孵育，再對抗體-互作蛋白質(zhì)復合物進(jìn)行純化；如果沒(méi)有對應的抗體，則需要引入標簽蛋白質(zhì)，利用標簽蛋白質(zhì)抗體完成Co-IP的實(shí)驗。
 
“確認過(guò)眼神，我遇上對的Kit?！笔褂肅apturem? IP&Co-IP將大量解放您的實(shí)驗時(shí)間，提高您的實(shí)驗效果，為您的實(shí)驗提供更多的選擇！