SMARTer Human scTCR a/b Profiling Kit—
闡明單細胞中T細胞受體Alpha-Beta 鏈配對
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· 工作流程靈活—可以利用FACS（流式細胞術(shù)）或手動(dòng)分選細胞構建 Illumina測序文庫
· 易于使用—優(yōu)化的index允許將96個(gè)細胞混合制成12個(gè)文庫，
并可以進(jìn)一步混合在一個(gè)flow-cell lane中測序
· 靈敏度高—基于RACE方法可以檢測低豐度TCR變異體
· 特異性好—完整reads，大部分reads可以比對到目標區域，提供準確鏈配對信息
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盡管批量T細胞測序有助于進(jìn)一步了解T細胞受體庫（TCR）多樣性，但是批量測序不能確定T細胞群內特定的alpha-beta 受體鏈配對信息。由于特定的TCR alpha-beta鏈配對介導抗原特異性，獲得配對信息對于深入了解抗原識別，靶向免疫治療TCR的有效設計至關(guān)重要，也有助于確立T細胞群的祖先關(guān)系。單個(gè)T細胞測序可以確定特定細胞的配對信息，但是價(jià)格可能非常昂貴并涉及復雜的分析，因為大部分方法需要對大量的細胞測序。
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使用SMARTer Human scTCR a/b Profiling Kit可以解決這些問(wèn)題，在SMART cDNA Synthesis中通過(guò)采用一系列indexed oligo可以將手動(dòng)或FACS分選的96個(gè)樣品制成12個(gè)測序pool，并且這12個(gè)pool可以進(jìn)一步混合，這樣所有的96個(gè)樣品可以在一個(gè)flow-cell lane 中測序。與用于大量樣品測序的SMARTer Human TCR a/b Profiling Kit 一樣，試劑采用了SMART cDNA synthesis和RACE方法，通過(guò)進(jìn)一步的TCR基因特異性PCR完整捕獲和擴增TCR-alpha 和TCR-beta可變區構建Illumina測序文庫，為T(mén)CR測序提供了一種高靈敏度的方法。
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如果您需要軟件對采用本試劑盒構建文庫測序獲得的數據進(jìn)行demultiplex分析，請登錄SMARTer Human scTCR Demultiplexer。
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圖1. 在單細胞水平進(jìn)行T細胞研究的優(yōu)勢。
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Panel A. T細胞受體alpha鏈 (TCR-α) 和beta鏈組成示意圖。 Panel B. 示意了難以從批量細胞測序數據中獲得alpha鏈 (TCR-α) 和beta鏈配對信息。針對稀有克隆型可以分析部分細胞中的配對信息（橙色克隆型），但是對于高表達的克隆型(TCRA V2J1, TCRA V2J2, TCRB V3D1J1, TCRB V2D1J2)可能有4種配對組合。
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圖2. SMARTer Human scTCR a/b Profiling Kit技術(shù)流程及pooling策略。
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Panel A. 第一鏈cDNA合成由dT引物（RT引物）起始，MMLV型逆轉錄酶（RT）會(huì )在mRNA 5’端添加幾個(gè)非模板核苷酸。SMART-Seq Indexed Oligos與這幾個(gè)非模板核苷酸互補結合作為模板，通過(guò)RT在第一鏈cDNA末端添加額外核苷酸序列（也就是模板轉換步驟）。試劑盒中提供8種不同的SMART-Seq Indexed Oligo，每一個(gè)SMART-Seq Indexed Oligo中內嵌唯一的六堿基index作為細胞barcode，用于下游pooling細胞的識別。通過(guò)RT添加到cDNA末端的額外序列-被稱(chēng)為“SMART sequence”-作為接下來(lái)幾輪PCR擴增的引物結合位點(diǎn)，確保只有來(lái)自于全長(cháng)cDNA的序列才能被擴增。經(jīng)過(guò)pool（Panel B所示）和純化后，通過(guò)連續兩輪基因特異性PCR擴增來(lái)自于TCR-α 和/或 TCR-β可變區的cDNA序列。第一輪PCR采用擴增過(guò)的雙鏈cDNA為模板，正向引物與SMART sequence互補，同時(shí)包含Illumina Read 2序列（TCR Primer 1），反向引物與TCR-α和TCR-β的恒定區（即不變區）互補（TCR a/b Human Primer 1）。第二輪PCR以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，采用的正向引物與第一輪PCR添加的Read 2 序列互補。反向引物與恒定區結合，位于PCR1 primers內側 (TCR a/b Human Primer 2 Reverse HT Index)，擴增TCR-α和TCR-β cDNA的完整可變區及部分恒定區。正向引物和反向引物包含適用于Illumina測序平臺的接頭序列和index，可以將多達96個(gè)樣品混合用于在一個(gè)flow-cell lane中測序。Panel B. 按列混合樣品，這樣每個(gè)pool中包含8個(gè)細胞，每個(gè)細胞帶有不同index的SMART-Seq Indexed Oligo 。在PCR 2中通過(guò)正向和反向HT indexes的不同組合使用，可以將多樣品進(jìn)一步混合在一個(gè)flow-cell lane 中測序（更多信息參見(jiàn)User Manual）。
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圖3. 96孔板中混合細胞群的分析。
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Panel A. 基于鑒別每孔的克隆型確定細胞種類(lèi)。遺漏的7個(gè)細胞沒(méi)能通過(guò)對高于閾值的TCR-α 或TCR-β的reads數分析確定克隆型。Panel B. 配對信息分析。分析獲得了平板中34個(gè)細胞的TCR-αβ配對克隆型。Panel C. 以百分比展示了分析細胞的alpha，beta，或alpha-beta配對信息。遺漏的細胞沒(méi)有包括在分析數據中。
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Technote：
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SMART human scTCR-seq：
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產(chǎn)品詳情請點(diǎn)擊以下鏈接：
http://www.clontech.com/CN/Products/cDNA_Synthesis_and_Library_Construction/Next_Gen
_Sequencing_Kits/human_scTCR_profiling_kit?sitex=10022:2237
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