PCR準則

聚合酶鏈式反應(PCR)是K.Mullis和其合作者在1985年發(fā)明的，它給分子生物學(xué)和分子醫學(xué)帶來(lái)了革命性的影響。一些主要的研究領(lǐng)域，包括生物標志物發(fā)現、基因調控和癌癥研究，不斷地提出更多的要求，對當今的PCR計術(shù)提出了更高的挑戰。這其中就包括對高通量、更高的實(shí)驗靈敏性以及更可靠的數據分析的要求。實(shí)驗的發(fā)展和評價(jià)，數據的可重復性，以及得到結果需要的時(shí)間，仍然是研究者所面臨的主要問(wèn)題。

PCR擴增是一種常規的技術(shù)，目前已經(jīng)發(fā)展了數以千計的PCR實(shí)驗方案，但是研究者仍然會(huì )遇到PCR實(shí)驗的技術(shù)困難，并經(jīng)常不能獲得特異性的PCR產(chǎn)物。盡管也有幾種其它的挑戰（比如，脫尾，低產(chǎn)率和非特異性擴增），PCR失敗或者結果較差的原因主要有兩個(gè)：反應的特異性和模板的二級結構。

PCR既是一個(gè)熱動(dòng)力學(xué)過(guò)程也是一個(gè)酶催化過(guò)程。成功的real-time PCR，需要在最佳的條件下進(jìn)行擴增和檢測，每一個(gè)反應成分都會(huì )影響結果。退火步驟對PCR反應的特異性非常關(guān)鍵。如果引物能夠與模板高度特異性的結合，則會(huì )提高特異性的PCR產(chǎn)物，并且增強擴增反應的靈敏性。但是由于反應中較高的引物濃度，引物可能會(huì )與非互補的序列雜交，發(fā)生錯配。如果引物與模板序列結合的特異性較低，可能會(huì )出現非特異性的PCR產(chǎn)物和引物二聚體。擴增反應中，預期PCR產(chǎn)物與假體的競爭，會(huì )降低特異性產(chǎn)物的產(chǎn)量，從而降低real-time PCR的靈敏性和線(xiàn)性范圍。較低的PCR特異性，能顯著(zhù)的影響PCR的定量檢測，特別是使用SYBR Green作為檢測試劑的時(shí)候。由于SYBR Green能夠與所有雙鏈DNA序列結合，引物二聚體以及其它非特異性的PCR產(chǎn)物都會(huì )產(chǎn)生熒光信號。這導致反應整體靈敏度降低，并導致對目標轉錄物的定量不準確。PCR反應中，對反應的特異性至關(guān)重要的因素包括，引物設計和所使用的反應化學(xué)試劑。

PCR引物設計

最佳的引物序列和合適的引物濃度，對于PCR反應達到最大的特異性和最高的效率至關(guān)重要。表“引物設計和使用準則”提供了標準和多重PCR以及一步法RT-PCR反應中，引物設計和使用的概述。

引物設計和使用準則

	標準PCR	多重PCR	一步法RT-PCR
片段長(cháng)度	18–30 nt	21–30 nt	18–30 nt
GC含量	40–60%	40–60%	40–60%
Tm信息	所有引物對應該具有類(lèi)似的Tm值	所有引物對應該具有類(lèi)似的Tm值。為了得到最佳的結果，Tm值應該在60–88°C之間。	所有引物對應該具有類(lèi)似的Tm值。Tm值不應低于逆轉錄的溫度（比如，50°C）
估計最佳退火溫度	比計算的Tm值低5°C	比計算的Tm值低5–8°C（當Tm高于68°C時(shí)）或者比計算的Tm值低3–6°C（當Tm在60–67°C之間時(shí)）	比計算的Tm值低5°C
位置	–	–	為了避免檢測到gDNA：引物應該與一個(gè)外顯子的3’端和相鄰外顯子的5’端雜交。 或者引物應該與覆蓋至少一個(gè)內含子的區域雜交。 如果僅知道mRNA序列，引物的結合位點(diǎn)應該相距300–400 bp。
濃度，與A260的單位吸光度對應的濃度相當	20–30 μg	20–30 μg	20–30 μg

PCR引物轉化為摩爾

引物長(cháng)度	pmol/μg	20 pmol
18mer	168	119 ng
20mer	152	132 ng
25mer	121	165 ng
30mer	101	198 ng

在設計PCR引物的時(shí)候，應該考慮如下因素，并且這些因素對于所有類(lèi)型的PCR都適用：

• T_m值計算：2°C x (A+T) + 4°C x (G+C)
• 避免引物對3’端的2–3個(gè)堿基互補
• 避免引物3’端與模板錯配
• 避免引物的3’端出現3個(gè)或者更多個(gè)C或者G
• 避免引物序列本身互補和引物對之間互補
• 避免3’端的末端堿基是T
• 確保引物序列對于模板序列是獨特的
• 每個(gè)引物的濃度應該在0.1–1.0 μM。對于很多應用而言，0.2 μM 的引物濃度就足夠了

凍干的引物應該在少量的蒸餾水或者TE中溶解，以制備濃縮的原液。制備濃度為10 pmol/μl的若干等分工作溶液，以避免重復冷凍和融解。所有的引物溶液儲存在 –20°C條件下。使用變性的聚丙烯酰胺凝膠來(lái)檢測引物的質(zhì)量，應該僅觀(guān)察到一個(gè)條帶。

PCR的條件

對于每個(gè)引物對，都應該優(yōu)化PCR緩沖溶液中的引物和Mg²⁺濃度以及反應的退火溫度，以高效率的進(jìn)行PCR反應。除此之外，一些能增強DNA聚合酶的穩定性和續進(jìn)性，或者通過(guò)降低非特異性的引物–模板相互作用而增強雜交的嚴格性的添加劑，也能改善PCR反應的效率(1)。使用高純度的反應試劑，對于PCR反應的成功非常關(guān)鍵，特別是對于稀有模板的擴增反應，比如，基因組DNA中的單個(gè)拷貝的基因或者從被感染的生物體中分離出來(lái)的基因組DNA上的病毒DNA序列。
對照反應對于監控PCR反應的成功是非常必要的。在任何可能的情況下，都應該使用陽(yáng)性對照，來(lái)確保使用的PCR的反應條件能成功的擴增目標序列。由于PCR是一種靈敏性極高的技術(shù)，僅需要目標模板的幾個(gè)拷貝，因此，一定要使用不含模板DNA的陰性對照，來(lái)確保PCR使用的溶液沒(méi)有被模板DNA分子所污染。

PCR反應應該與PCR分析在互相隔離的區域內進(jìn)行，以確保PCR使用的試劑沒(méi)有被PCR產(chǎn)物所污染。同樣，分析PCR產(chǎn)物時(shí)使用的試管，絕對不能用于PCR反應。

引物退火的特異性與PCR緩沖溶液

在PCR反應中，引物與模板上互補的DNA序列發(fā)生退火。對于成功的擴增，引物退火必須具有特異性。為了在較短的退火時(shí)間內有效的雜交，引物的濃度必須很高，這會(huì )導致引物與非互補的序列退火。非特異性退火所產(chǎn)生的擴增產(chǎn)物，能夠與特異性的擴增競爭，并極大的減少特異性產(chǎn)物的產(chǎn)量。

成功的PCR反應，需要維持較高的引物分子特異性退火和非特異性退火的比例。退火主要受到PCR緩沖溶液的成份（特別是陽(yáng)離子）和退火溫度的影響。特殊的陽(yáng)離子組合，能在較大的退火溫度范圍內保持較高的退火特異性。這使得不再需要對于每一種引物–模板體系都優(yōu)化退火溫度，并且允許使用具有不同的引物退火溫度的非理想的PCR實(shí)驗。

退火溫度

最佳的引物退火溫度取決于堿基的組成（即A、T、G、C核苷酸的比例）、引物濃度和離子反應環(huán)境。

鎂離子的濃度

鎂離子是DNA聚合酶重要的輔助因子，對于酶的活性非常關(guān)鍵。Mg²⁺與擴增反應中的DNA，引物和核苷酸相結合。Mg²⁺的濃度通常要高于dNTP和引物，并且針對于不同的模板和引物，其濃度需要進(jìn)行優(yōu)化。如果Mg²⁺的濃度高于最佳濃度，那么會(huì )穩定非特異性的結合，從而導致特異性的PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量降低，并且導致其它PCR假體和背景脫尾的出現。

PCR添加劑

有多種PCR添加劑或者增強劑能改善PCR的結果。這些試劑通過(guò)解除DNA的二級結構（比如，高GC含量的區域或者長(cháng)擴增產(chǎn)物上的二級結構），降低模板的解鏈溫度，增強酶的續進(jìn)性，穩定DNA聚合酶或者阻止聚合酶黏附到塑料耗材上，發(fā)揮作用。

常用的PCR添加劑包括二甲基亞砜(DMSO)、牛血清蛋白(BSA)和甘油。

簡(jiǎn)并引物設計和使用準則

如果靶標的精確核苷酸序列未知，則通?？蓮陌被嵝蛄型茢郟CR引物序列。然而，由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，推斷的序列可能在一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)出現變異。在這些情況下，一種常見(jiàn)的解決方法是使用簡(jiǎn)并引物，它是在可變位點(diǎn)由具有不同堿基構成的相似引物的混合物。使用簡(jiǎn)并引物可導致PCR測定優(yōu)化困難：在簡(jiǎn)并引物混合物中僅有有限數量的引物分子與模板互補；引物序列的解鏈溫度(T_m)可以顯著(zhù)不同，而某些引物的序列可以與其他引物序列互補。由于這些原因，擴增條件必需最大限度地減少非特異性引物–模板和引物–引物相互作用。設計和使用簡(jiǎn)并引物時(shí)，以下準則可能會(huì )有所幫助。

引物序列：

• 避免3'末端3個(gè)核苷酸的簡(jiǎn)并性，例如，如果可能的話(huà)，使用蛋氨酸或色氨酸編碼三聯(lián)體的3'末端
• 為了增加引物–模板的結合效率，通過(guò)允許引物和模板之間的一些錯配以降低簡(jiǎn)并性，特別是對5'末端，而不是3'末端
• 嘗試在任何給定的位點(diǎn)以小于4倍簡(jiǎn)并性設計引物

引物濃度：

• 以0.2 μM引物濃度開(kāi)始進(jìn)行PCR
• 如果PCR效率不高，則以0.25 μM為單位遞增引物濃度直到得到滿(mǎn)意的結果

長(cháng)PCR產(chǎn)物的擴增

使用非特異性的引物退火，未達最佳標準的循環(huán)條件以及二級結構的DNA模板受到損害等都可造成PCR擴增產(chǎn)物長(cháng)度超過(guò)3–4 kb。通過(guò)改變各種因素（例如循環(huán)條件、引物和dNTP的濃度以及特殊添加劑等）對冗長(cháng)的序列進(jìn)行優(yōu)化通常是必要的。

優(yōu)化循環(huán)條件

在標準PCR中脫嘌呤化通常不是問(wèn)題，雖然它可以顯著(zhù)影響長(cháng)PCR片段的擴增。這是因為長(cháng)模板脫嘌呤化比例高于短模板。由于這個(gè)原因，相較于變性步驟為30秒或1分鐘，只有10秒的變性步驟可以得到更高的產(chǎn)率并且無(wú)背景污染（這會(huì )導致PCR失?。?。在最后延伸步驟也觀(guān)察到廣泛的脫嘌呤化。因此，延伸溫度為更低的68°C而非72°C時(shí)，可以大幅度提高長(cháng)擴增產(chǎn)物的產(chǎn)量。

長(cháng)PCR產(chǎn)物理想的循環(huán)條件請見(jiàn)下表。

長(cháng)PCR產(chǎn)物擴增的循環(huán)條件

* 比引物的Tm低5°C。

步驟	時(shí)間/循環(huán)	溫度
初始活化階段	2 min	95°C
3步循環(huán)
變性	10 s	94°C
退火	1 min	50–68°C*
延伸	1 min/kb
循環(huán)數	40個(gè)循環(huán)	68°C
PCR循環(huán)結束	無(wú)限	4°C

優(yōu)化PCR添加劑

發(fā)夾環(huán)狀結構等二級結構往往是由富集GC模板延伸，長(cháng)PCR產(chǎn)物高效擴增受到干擾造成的。這個(gè)問(wèn)題可以通過(guò)添加試劑改變DNA解鏈方式以幫助解決低溫下的二級結構來(lái)克服。

優(yōu)化3'到5'核酸外切酶活性

復制模板時(shí)，相比所謂的標定DNA聚合酶，Taq DNA聚合酶會(huì )引入更多的錯配到PCR產(chǎn)物中。一旦在合成過(guò)程中發(fā)生錯配，Taq DNA聚合酶將延伸錯配的鏈或脫離模板鏈，從而分別導致突變或PCR產(chǎn)物不完整。雖然這在擴增短PCR片段時(shí)通常不會(huì )影響PCR效率，但是長(cháng)PCR產(chǎn)物的擴增可以通過(guò)DNA合成過(guò)程中引入錯配而受到顯著(zhù)影響。

校對DNA聚合酶包含一種內在的3'到5'核酸內切酶活性，可以去除錯配的堿基對。加入少量的校對DNA聚合酶到PCR反應混合物中，可以顯著(zhù)提高長(cháng)PCR產(chǎn)物的擴增效率。

用于PCR的酶

數種類(lèi)型的熱穩定DNA聚合酶都可在PCR中使用，這里我們提供了酶性質(zhì)的選擇，請參閱表“用于PCR的DNA聚合酶 ”。

分離自真細菌屬水生棲熱菌的Taq DNA聚合酶，是標準終點(diǎn)定量PCR最常用的酶。這種酶的穩健性使其可以在許多不同的PCR測定中使用。然而，由于這種酶是在室溫下具有活性，其反應準備有必要在冰上進(jìn)行，以避免發(fā)生非特異性擴增。

許多原來(lái)的“PCR聚合酶”需要進(jìn)行修飾才能使用，但是現在Taq DNA聚合酶無(wú)需修飾即可用于不同的下游應用，如熱啟動(dòng)、單細胞、高保真或多重PCR。萬(wàn)分之一個(gè)核苷酸的平均錯配率使得Taq DNA聚合酶和它的變種的精確度不如B族耐熱DNA聚合酶。但是，由于它的多功能性，Taq DNA聚合酶仍然是當涉及到嚴格的熱啟動(dòng)時(shí)常規應用最多選擇的酶，適用于多種高難度的PCR應用。

用于PCR的DNA聚合酶

來(lái)自參考文獻2。

酶的性質(zhì)	DNA聚合酶家族A	DNA聚合酶家族B
可用的酶	Taq DNA聚合酶	校正酶
5'–3'核酸外切酶活性	+	–
3'–5'核酸外切酶活性	–	+
延伸速率（核苷酸/秒）	~150	~25
錯配率（per bp/per cycle）	1 in 103/104	1 in 105/106
PCR應用	標準、熱啟動(dòng)、逆轉錄、real-time	高保真、克隆、定點(diǎn)誘變
A-addition	+	有時(shí)

熱啟動(dòng)DNA聚合酶

在室溫下進(jìn)行擴增反應準備時(shí)，引物可非特異性地相互結合，形成引物二聚體。在擴增循環(huán)中，引物二聚體可以擴展并產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物，從而降低了特異性產(chǎn)物的產(chǎn)率。對于那些高難度的PCR應用，熱啟動(dòng)PCR對特異性結果至關(guān)重要。為了產(chǎn)生熱啟動(dòng)DNA聚合酶，Taq DNA聚合酶活性可在較低溫度下用抗體，或者通過(guò)更有效的化學(xué)修飾，與所述聚合酶的氨基酸形成共價(jià)鍵的方式來(lái)進(jìn)行抑制?；瘜W(xué)修飾導致聚合酶完全失活，直到所形成共價(jià)鍵在最初的熱活化步驟被分解。與此相反，抗體介導的熱啟動(dòng)步驟，抗體通過(guò)相對較弱的非共價(jià)力結合聚合酶，這使某些聚合酶分子仍處于激活狀態(tài)。這有時(shí)會(huì )導致可在PCR過(guò)程中被進(jìn)一步擴增的非特異性引物延伸產(chǎn)物的出現。在瓊脂糖凝膠上電泳時(shí)，這些產(chǎn)物就會(huì )呈現出背景污染或成為尺寸大小不正確的片段。

高保真DNA聚合酶

與標準的DNA聚合酶（如 Taq DNA聚合酶）不同，高保真PCR酶通常具有去除錯誤摻入堿基的3'到5'外切酶活性。高保真PCR酶非常適合于要求低錯配率，如克隆、測序和位點(diǎn)定向誘變的應用。然而，如果該酶沒(méi)有熱啟動(dòng)功能，3'到5'外切酶活性可以在PCR準備過(guò)程和PCR的早期階段中降解引物?？s短的引物造成的非特異性引發(fā)將會(huì )導致凝膠上的背景污染或者擴增失敗，尤其是當所使用模板較少時(shí)。應當指出的是，校對功能往往導致高保真酶比其它DNA聚合酶起效更慢。此外，直接UA–或TA–克隆所需的A–addition功能將強烈降低，導致鈍端克隆需要具有較低的連接和轉化效率。

PCR循環(huán)

從理論上說(shuō)，在反應中每個(gè)PCR循環(huán)將擴增子的量擴大到兩倍。因此，10個(gè)循環(huán)后的量為約1000因子乘以擴增子的量，以此類(lèi)推。

每個(gè)PCR循環(huán)都包括模板變性、引物退火和引物延伸等階段。如果某個(gè)溫度下退火和延伸是相似的，則這兩個(gè)過(guò)程可以組合。循環(huán)的每個(gè)階段，對于每個(gè)模板和引物對組合而言，都要對其反應時(shí)間和溫度進(jìn)行優(yōu)化。

達到循環(huán)所需數量之后，擴增產(chǎn)物可以在下游應用中被分析或使用。

PCR循環(huán)數確定準則

1 kb DNA片段的量	E. coli DNA的量	人類(lèi)DNA的量	單拷貝基因數量	PCR循環(huán)數
0.0.1–0.11 fg	0.05–0.56 pg	36–360 pg	10–100	40–45
0.11–1.1 fg	0.56–5.56 pg	0.36–3.6 ng	100–1000	35–40
1.1–5.5 fg	5.56–278 pg	3.6–179 ng	1 x 103–5 x 104	30–35
>5.5 fg	>278 pg	>179 ng	>5 x 104	25–35

PCR常用術(shù)語(yǔ)

在數據分析中使用的基本術(shù)語(yǔ)如下。有關(guān)數據分析的更多信息，請參閱real-time PCR廠(chǎng)商建議。數據顯示為S形的擴增曲線(xiàn)（使用線(xiàn)性標度時(shí)），其中熒光值對循環(huán)數量繪圖。

之前的目標核酸水平可以在real-time PCR中進(jìn)行定量，分析原始數據并設置基線(xiàn)值和閾值。當不同的探針被用在單次實(shí)驗中（例如當平行分析幾個(gè)基因或當所使用探針攜帶不同標記染料），必須為每個(gè)探針調整基線(xiàn)與閾值的設置。

此外，使用SYBR Green檢測方法分析單次實(shí)驗不同的PCR產(chǎn)物時(shí)，需要為每個(gè)單獨的檢測調整基線(xiàn)和閾值。

基線(xiàn)：基線(xiàn)是早期循環(huán)的噪點(diǎn)水平，通常在第3和第15循環(huán)之間測量，這是因為在此期間還檢測不到擴增產(chǎn)物引起的熒光值增加。用于計算基線(xiàn)的循環(huán)數量是可以改變的，如果使用高模板量或者靶標基因的表達水平高則循環(huán)數量需要減少。設置基線(xiàn)需要查看線(xiàn)性度擴增曲線(xiàn)的熒光數據。設置基線(xiàn)，使得擴增曲線(xiàn)的增長(cháng)所開(kāi)始的循環(huán)圈數大于基線(xiàn)循環(huán)最高圈數。對每個(gè)靶標序列都需要單獨設置基線(xiàn)。早期循環(huán)檢測到的平均熒光值需要從擴增產(chǎn)物中獲得的熒光值中減去。各種real-timePCR軟件的最新版本允許單個(gè)樣品自動(dòng)優(yōu)化基線(xiàn)設置。

本底：是指反應中的非特異性熒光值，例如，低效率的熒光淬滅，或由于使用SYBR Green造成的大量雙鏈DNA模板。信號的本底分量由real-time PCR軟件算法數學(xué)除去。

報告基因信號 ：在real-time PCR過(guò)程中由SYBR Green或熒光標記的序列特異性探針產(chǎn)生的熒光信號。

歸一化報告信號（RN）：這是報告染料熒光強度除以在每個(gè)循環(huán)中測量的被動(dòng)參照染料的熒光強度。

被動(dòng)參比染料 ：在某些real-time PCR中，熒光染料ROX被用作熒光信號標準化內部參照。它可以逐孔校正因校正因移液不準確、孔位置及熒光波動(dòng)造成的變動(dòng)。

閾值：閾值調整到本底值之上并顯著(zhù)低于擴增曲線(xiàn)的平穩值。它必須處于擴增曲線(xiàn)的線(xiàn)性區域內，代表了PCR檢出的對數線(xiàn)性范圍。閾值應在對數擴增曲線(xiàn)視圖中進(jìn)行設置，以使PCR的對數線(xiàn)性期易于識別。如果real-time PCR中有多個(gè)目標基因，閾值必須為每個(gè)目標進(jìn)行設定。

循環(huán)閾值(C_T)或交叉點(diǎn)（CP）：擴增曲線(xiàn)穿過(guò)閾值的循環(huán)（即，熒光檢測值顯著(zhù)增加的點(diǎn)）。C_T可以是一個(gè)分數，并且可以計算起始模板量。

ΔC_T值： ΔC_T值描述了靶標基因和相應的內參基因CT值的差值，例如看家基因，并用于標準化模板的使用量：

• ΔC_T = C_T (靶標基因) – C_T (內源性參比基因)
• ΔΔC_T值：ΔΔC_T值描述了感興趣樣品（例如，刺激細胞）的平均ΔΔC_T值與參考樣本（例如，未刺激細胞）的平均ΔΔC_T值之間的差值。參照樣品也被稱(chēng)為校準樣品，并且所有其它樣品進(jìn)行相對定量時(shí)都將被標準化到如此：
• ΔΔC_T = 平均ΔC_T (感興趣樣品) – 平均ΔC_T (參比樣本)

內源性參比基因：e這種基因的表達水平在樣品間不存在差異，例如看家基因(3)。對比內參基因與靶標基因的C_T值可以將靶標基因的表達水平歸一化到輸入的RNA或cDNA的量（見(jiàn)上面關(guān)于ΔC_T值部分）。反應中模板的確切數量不確定。內參基因對以下情況作出校正：可能的RNA降解或RNA樣品中存在酶抑制劑的情況，以及RNA含量、逆轉錄效率、核酸回收和樣品處理的變動(dòng)。為了選出最優(yōu)的參照基因（多個(gè)），我們對算法進(jìn)行了改進(jìn)，允許其選擇依賴(lài)于實(shí)驗設置最優(yōu)參照（4）。

內參：在同一反應中被作為靶序列擴增的，并用不同的探針（即，進(jìn)行雙重PCR）檢測的對照序列。內參經(jīng)常被用來(lái)排除失敗的擴增，例如沒(méi)有檢測到目標序列的情況。

標定樣品：在相對定量中使用的參比樣品（例如，源自細胞株或組織純化的RNA），用以與所有其他樣品進(jìn)行比較，以確定某一基因的相對表達水平。標定樣品可以是任何樣品，但通常是一個(gè)對照品（例如，未處理的樣品或來(lái)自實(shí)驗零時(shí)的樣品）。

陽(yáng)性對照：使用已知量模板的對照反應。陽(yáng)性對照通常用來(lái)檢查引物集或引物–探針集工作是否正常，以及反應是否正確設置。

無(wú)模板對照（NTC）：包含除模板之外的所有擴增反應所必要組分的對照反應。這使得發(fā)現由于污染的試劑或外源DNA造成的污染成為可能，例如從以前的PCR中。

無(wú)RT對照： RNA制備物可能含有殘留的基因組DNA，如果檢測不被設計為僅檢測和擴增RNA序列,其可以在real-time RT-PCR中進(jìn)行檢測。DNA污染可以通過(guò)操作在其中沒(méi)有加入逆轉錄酶的RT對照反應來(lái)進(jìn)行檢測。

標準品：已知濃度或拷貝數，用于構建標準曲線(xiàn)的樣品。

標準曲線(xiàn)：要生成標準曲線(xiàn)，C_T值/不同標準稀釋的交叉點(diǎn)對標準物質(zhì)輸入量的對數繪圖。標準曲線(xiàn)通常是使用至少5種不同濃度的標準稀釋倍比生成。每個(gè)標準曲線(xiàn)，應檢查其有效性，斜率值落在–3.3到–3.8之間。標準是各濃度一式三份的理想測定值。標準曲線(xiàn)的斜率如果與這些值差異較大則應該舍棄。

效率和斜率：標準曲線(xiàn)的斜率提供了對real-time PCR的效率指示。斜率–3.322表示該PCR具有數值為1的效率，或100％的效率，并且PCR產(chǎn)物的量在每個(gè)循環(huán)增加到兩倍。效率小于–3.322（例如，–3.8）則表示PCR的效率<1。通常，大多數擴增反應因為實(shí)驗的限制不能達到100％的效率。斜率大于–3.322（例如，–3.0）表明PCR效率似乎是大于100％的。當在反應中的非線(xiàn)性期對值進(jìn)行測量時(shí)可能發(fā)生這種情況，或者它可以指示是否有抑制劑存在。

real-time PCR檢測的效率可以通過(guò)分析一個(gè)模板稀釋系列來(lái)計算，C_T值對模板量對數進(jìn)行繪圖，并確定最終標準曲線(xiàn)的斜率。從斜率（S），效率可以用下面的公式計算：PCR效率(%) = (10(–1/S) – 1) x 100

Real-time PCR

Real-time PCR與RT-PCR（也稱(chēng)為定量PCR或qPCR）能夠對DNA、cDNA和RNA靶標的起始數目進(jìn)行精確定量。該方法在每個(gè)反應循環(huán)中對所發(fā)出的熒光進(jìn)行測定，隨著(zhù)反應的動(dòng)態(tài)范圍極大地增加，其伴隨產(chǎn)生的熒光與PCR產(chǎn)物之間也成比例的增加。PCR產(chǎn)物能夠通過(guò)與雙鏈DNA結合的熒光染料，或通過(guò)具有熒光標記的序列特異性探針進(jìn)行檢測。

何為SYBR Green PCR？

SYBR Green I熒光染料能夠結合雙鏈DNA分子，并伴隨結合反應的發(fā)生在固定波長(cháng)發(fā)出熒光信號。SYBR Green I染料的激發(fā)和發(fā)射光譜分別為494 nm和521 nm，這使得該染料能夠相容任何種類(lèi)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。對PCR產(chǎn)物的檢測是在real-time PCR的擴增期進(jìn)行的。伴隨著(zhù)反應循環(huán)數的增加，熒光信號強度也由于PCR產(chǎn)物的積累而逐漸增加。使用SYBR Green染料能夠實(shí)現對許多不同種類(lèi)靶標的分析，而無(wú)需合成靶標特異性的標記探針。不過(guò)，非特異性的PCR產(chǎn)物和引物二聚體也會(huì )發(fā)出熒光信號。因此，使用SYBR Green染料時(shí)需要高度的PCR反應特異性。

何為基于探針的PCR？

熒光標記探針提供了一種高靈敏度的檢測方法，在該方法中只有目的PCR產(chǎn)物才會(huì )得到檢測。不過(guò)，PCR反應的特異性對于序列特異性探針的使用也同樣重要。擴增反應中的人為干擾，如非特異性的PCR產(chǎn)物和引物二聚體也可能伴隨性地生成，導致目的PCR產(chǎn)物豐度的降低。特異性產(chǎn)物與反應中的人為干擾物之間存在對反應成份的競爭，這會(huì )降低分析的效率和靈敏度。以下類(lèi)型的化學(xué)探針經(jīng)常被使用。

TaqMan探針: 序列特異性的寡聚核苷酸探針，帶有一個(gè)熒光基團和一個(gè)淬滅基團。熒光基團偶聯(lián)于探針的5'端，淬滅基團則附于3'端。在PCR的結合退火/鏈延伸期，探針被Taq DNA聚合酶的5'–3'的核酸外切酶活性所切斷，導致熒光基團與淬滅基團的分離。從而生成了與積累的PCR產(chǎn)物數量成比例的可檢測熒光。.

FRET探針：在使用熒光能量共振轉移（FRET）探針的PCR反應中，兩個(gè)已標記的寡聚核苷酸探針?lè )謩e以頭尾相接的形式結合至PCR產(chǎn)物上。當兩個(gè)探針同時(shí)結合到PCR產(chǎn)物上時(shí)，它們的熒光基團足夠接近，導致能量從供體熒光基團轉移至受體熒光基團。因此，在PCR反應的退火階段能夠產(chǎn)生與PCR產(chǎn)物數量成比例的熒光。由于FRET系統中使用了兩條引物和兩條探針，因此良好設計的引物和探針的是獲得成功結果的關(guān)鍵。

在real-time PCR中作為熒光探針的染料：需對real-time PCR中所使用的序列特異性探針進(jìn)行標記時(shí)，有多種多樣的熒光染料可供選擇，每一種染料都有其特定的激發(fā)峰值和發(fā)射峰值。廣泛可選的染料使得多重real-time PCR技術(shù)成為可能（同一反應中檢測兩個(gè)乃至更多的擴增子）：所選擇染料的激發(fā)光譜能夠與實(shí)時(shí)定量PCR儀的檢測范圍相容（不沖突），而它們的發(fā)射光譜又能夠充分地相互區別。因此，當進(jìn)行多重PCR時(shí)，最好使用波道間距最寬的那些染料，以盡可能避免發(fā)生任何潛在的交互信號干擾。

其他探針：許多探針供應商研發(fā)了他們自主專(zhuān)利的染料。需要更為詳盡的資料，請參閱供應商各自的主頁(yè)。

定量real-time PCR中常用的染料

*發(fā)射光譜根據緩沖條件而變化。

染料	最大激發(fā)光波長(cháng)(nm)	最大發(fā)射光波長(cháng)(nm)*
熒光素	490	513
Oregon Green	492	517
FAM	494	518
SYBR Green I	494	521
TET	521	538
JOE	520	548
VIC	538	552
Yakima Yellow	526	552
HEX	535	553
Cy3	552	570
Bodipy TMR	544	574
NED	546	575
TAMRA	560	582
Cy3.5	588	604
ROX	587	607
Texas Red	596	615
LightCycler Red 640 (LC640)	625	640
Bodipy 630/650	625	640
Alexa Fluor 647	650	666
Cy5	643	667
Alexa Fluor 660	663	690
Cy 5.5	683	707

PCR定量檢測

靶標核酸可以通過(guò)絕對定量法或相對定量法來(lái)進(jìn)行量化。

絕對定量法能夠確定靶標核酸的絕對數量（表示為拷貝數或濃度），而相對定量法作為分析的第一步，能夠表明靶標數量與參照（例如一個(gè)內源性對照分子，通常為一個(gè)合適的看家基因）數量之間的比例。之后即可使用這個(gè)標準化數值來(lái)進(jìn)行比較，例如，進(jìn)行不同樣本中不同基因的表達水平之間的比較。

何為絕對定量？

使用外部標準將基因表達水平確定為絕對拷貝數值。對于基因表達分析，最為精確的標準物是已知拷貝數或濃度的RNA分子?；诎袠说男蛄泻徒Y構以及逆轉錄的效率，（通常情況下）RNA樣本中只有一部分靶標RNA能夠完成逆轉錄。逆轉錄過(guò)程中生成的cDNA隨后將在real-time PCR作為反應模板。RNA標準品的使用也需要考慮到逆轉錄的可變效率。

可以使用5個(gè)不同濃度的標準品梯度稀釋產(chǎn)物來(lái)創(chuàng )建標準曲線(xiàn)（C_T值/不同標準稀釋液的交點(diǎn)相對標準品豐度的對數值進(jìn)行作圖）。未知靶標的數量應位于所測試的區間內。標準稀釋品和靶標序列的擴增反應應于獨立的反應孔內進(jìn)行。首先確定標準品的C_T值。之后將未知樣本的C_T值與標準曲線(xiàn)進(jìn)行比較，以確定未知樣品中的靶標數量。為需要定量的核酸種類(lèi)選擇適當的標準品是十分重要的。作為標準品核酸，其拷貝數或濃度必須已知。此外，標準品還需具備以下特征：

• 引物和探針的結合位點(diǎn)與需定量的靶標一致
• 引物結合位點(diǎn)之間的序列與靶標序列一致或高度相似
• 擴增序列的上下游序列與“天然”靶標一致或相似
• 標準品和靶標分子具有相同的擴增效率

用于絕對定量的RNA標準品

RNA標準品可以通過(guò)將目的轉錄本部分或全部地克隆至一個(gè)標準載體中來(lái)獲得。插入片段可以源自總RNA或mRNA樣本的RT-PCR反應，或通過(guò)PCR反應擴增cDNA來(lái)獲得?？寺≥d體必須包含一個(gè)RNA聚合酶的啟動(dòng)子，例如T7、SP6或T3。請確保插入物的體外轉錄能夠生成有義鏈轉錄本。體外轉錄反應之后，必須使用不含RNase的的DNase降解質(zhì)粒DNA，因為殘余的質(zhì)粒DNA將會(huì )在分光光度測定RNA濃度的過(guò)程中造成錯誤，并在后續的PCR反應中充當（錯誤的）模板。而且，請在凝膠或毛細管電泳中驗證標準品RNA作為一單獨條帶進(jìn)行移動(dòng)，以確保其不含任何降解產(chǎn)物或異常轉錄本。

通過(guò)分光光度計測定RNA的濃度之后，標準RNA分子的拷貝數可以按照以下公式進(jìn)行計算：

（X g/μl RNA/[核酸轉錄本長(cháng)度x340]）x6.022x10²³=Y分子個(gè)數/μl

使用體外轉錄物作為RNA標準品的另一替代方法是使用確定的RNA制備物（例如源自細胞系或病毒的制備物），這類(lèi)RNA標準品中靶標的絕對濃度是已知的。

用于絕對定量的RNA標準品

質(zhì)粒DNA：最為常見(jiàn)的建立DNA標準品的方法是向標準載體中克隆一種PCR產(chǎn)物。該法的優(yōu)勢在于能夠方便地制備大量標準品，其同一性可以通過(guò)測序進(jìn)行確證，而這些DNA也能夠通過(guò)分光光度測定法容易地進(jìn)行定量。用于擴增的質(zhì)粒標準品應該是靶標序列上游或下游的線(xiàn)性化片段，而非超螺旋化質(zhì)粒。這是因為線(xiàn)性化質(zhì)粒的擴增效率通常不同于超螺旋化構象的質(zhì)粒，前者能夠更好地反映基因組DNA或cDNA的擴增效率。

當使用分光光度法測定質(zhì)粒DNA的濃度之后，標準DNA分子的拷貝數可以按照下列公式進(jìn)行計算：

（X g/μl DNA/[質(zhì)粒的堿基對長(cháng)度x600]）x6.022x10²³= Y 分子個(gè)數/μl

PCR片段：包含靶標序列的一條PCR產(chǎn)物也可作為DNA標準品。我們建議使用包含擴增子引物結合位點(diǎn)上下游至少20bp的PCR片段?？芍苯右觅|(zhì)粒DNA的計算公式（見(jiàn)上），將“質(zhì)粒長(cháng)度”換為PCR產(chǎn)物長(cháng)度即可。

基因組DNA：如果感興趣的靶標在單倍體基因組僅存一份拷貝，并且假基因和/或高度近似序列的擴增可以排除，則基因組DNA也可以作為絕對定量的DNA標準品來(lái)使用。如果該物種的基因組大小已知，那么可直接計算基因組中靶標的拷貝數。例如，小鼠的基因組大?。▎伪扼w）是2.7x10⁹ bp，分子量為1.78x10¹²道爾頓。

那么1.78x10¹² g基因組DNA相當于6.022x10²³份單拷貝基因。

1 μg基因組DNA相當于3.4x10⁵份單拷貝基因。

何為相對定量？

在相對定量中，需要確定靶基因數量與參比基因（例如一個(gè)在所有樣本中都存在的內參基因）數量之間的比值。該比值隨后被用于不同樣本之間的比較。在基因表達分析當中，看家基因或維持基因通常被選擇作為內源性對照。同一樣本中的靶標基因和參比基因，被分開(kāi)進(jìn)行擴增，或在同一反應中被共同擴增（多重real-time PCR）。對每一個(gè)樣本確定標準化數值，舉例來(lái)說(shuō)，該標準化數值能夠用于比較同一基因在不同組織中的差異表達情況，或對siRNA轉染細胞與非轉染細胞之間的基因表達水平進(jìn)行比較。不過(guò)，內參基因的表達水平在不同實(shí)驗條件或不同組織狀態(tài)（例如“受刺激”與“未刺激”樣本）中不能發(fā)生變化。當比較樣本之間的基因表達水平時(shí)，受刺激細胞中靶標的表達水平可能相對于未刺激細胞高出100倍（舉例來(lái)說(shuō)）。靶標和內參基因以同等或不等的效率完成擴增，定量的結果將會(huì )不同。

測定擴增效率

兩個(gè)基因（靶點(diǎn)A和B）的擴增效率可以通過(guò)從參考RNA或cDNA制備兩個(gè)基因的梯度稀釋樣品來(lái)進(jìn)行比較。每一梯度稀釋樣品都通過(guò)一步或兩步法的real-time RT-PCR進(jìn)行擴增，并以獲得的CT值建立關(guān)于靶點(diǎn)A和B的標準曲線(xiàn)。每一靶點(diǎn)的擴增效率（E）可以按照以下公式進(jìn)行計算：

E = 10^(–1/S) – 1 (S=標準曲線(xiàn)的斜率)

為了比較兩個(gè)靶標序列的擴增效率，使用靶點(diǎn)B的C_T值減去靶點(diǎn)A的C_T值。再以C_T值之間的差值相對于模板量的對數進(jìn)行作圖。如果得到的直線(xiàn)斜率小于0.1，則可視為擴增效率相當。

不同的擴增效率

靶基因和內參基因的擴增效率通常是不同的，因為兩者之間的引物退火效率，所擴增序列的GC含量以及PCR產(chǎn)物大小通常都存在差異。在這種情況下，例如使用對照細胞系的總RNA（標定或參考樣品）時(shí)，需同時(shí)對靶基因和內參基因建立標準曲線(xiàn)。

由于PCR效率之間存在區別，因此所得結果的標準曲線(xiàn)將不會(huì )平行，即當模板量變化時(shí)，靶基因與參考基因之間的C_T值差異不會(huì )為常數。

不同擴增效率下的相對定量指南：

• 選擇適當的內參基因，其表達水平在實(shí)驗條件下或不同組織之間不應發(fā)生變化。
• 制備cDNA或RNA對照樣本的倍比稀釋樣品（例如5或10倍的稀釋比例），以建立靶基因和參考基因的標準曲線(xiàn)。
• 進(jìn)行real-time PCR/RT-PCR反應。
• 確定標準品和目的樣品的C_T值。
• 通過(guò)將C_T值（Y軸）相比模板量或稀釋品的對數值（X軸）進(jìn)行繪圖，為靶基因和參考基因建立標準曲線(xiàn)。
• 使用C_T值及對應的標準曲線(xiàn)來(lái)計算樣品中靶基因和參考基因的數量。
• 將靶基因的豐度值除以參考基因的豐度值，以對靶基因的數量進(jìn)行標準化（如果反應重復多次，則應使用平均值）。
• 定義校驗樣本，并將靶基因的標準化數量除以校驗樣本的對應數值，來(lái)比較樣品中靶基因的相對表達水平。

相當的擴增效率

如果靶基因與內參基因的擴增效率相當，則只對參考基因建立一個(gè)標準曲線(xiàn)即可。在這種條件下，當模板數量變化時(shí)，靶基因與參考基因之間C_T值的差異為一個(gè)常數。未知樣本中靶基因與參考基因的豐度，通過(guò)將C_T值與參考基因的標準曲線(xiàn)進(jìn)行比較來(lái)計算。

相當擴增效率下的相對定量指南：

• 選擇適當的內參基因，其表達水平在實(shí)驗條件下或不同組織之間不應發(fā)生變化。
• 制備cDNA或RNA對照樣本的倍比稀釋樣品（例如5或10倍的稀釋比例），僅為內參基因建立標準曲線(xiàn)。
• 進(jìn)行real-time PCR/RT-PCR反應。
• 確定標準品和目的樣品的C_T值。
• 將C_T值（Y軸）相比模板或稀釋樣品豐度的對數值（X軸）進(jìn)行作圖，為內參基因建立標準曲線(xiàn)。
• 使用C_T 值及標準曲線(xiàn)來(lái)計算樣品中靶基因和參考基因的數量。
• 將靶基因的豐度值除以參考基因的豐度值，以對靶基因的數量進(jìn)行標準化（如果反應重復多次，則應使用平均值）。
• 定義標定樣本，并將靶基因的標準化數量除以校驗樣本的對應數值，來(lái)比較樣品中靶基因的相對表達水平。

相對定量的比較法或ΔΔC_T法

另一種替代方法稱(chēng)為比較或ΔΔC_T法，該法基于對C_T值的直接比較。在初始實(shí)驗中建立標準曲線(xiàn)只為確定靶基因和內參基因的擴增效率。在所有后續實(shí)驗中，無(wú)需為靶標序列建立標準曲線(xiàn)。如果擴增效率相同，靶點(diǎn)的數量只需簡(jiǎn)單使用C_T值，以如下方法進(jìn)行計算。

首先，通過(guò)計算靶基因與內參基因C_T值之間的差值來(lái)確定每個(gè)樣品的ΔC_T值。每一未知樣本及校驗樣本都需要確定該值。

• ΔC_T (樣本) = C_T靶基因– C_T 參比基因
• ΔC_T (校驗樣本) = C_T 靶基因– C_T 參比基因

之后，通過(guò)使用樣本的ΔC_T值減去校驗樣本的ΔC_T值，獲得每一樣本的ΔΔC_T值。

• ΔΔC_T = ΔC_T (樣本) – ΔC_T (校驗樣本)

如果靶基因與內參基因之間的PCR效率相同，則靶基因表達水平的標準化值可通過(guò)下列公式進(jìn)行計算：

• 樣品中靶基因的標準化表達水平= 2^–ΔΔCT

不過(guò)，如果靶基因與內參基因之間的PCR效率不同，則該定量方法會(huì )導致對基因表達水平的錯誤估計。

該誤差值是關(guān)于PCR效率與循環(huán)數的一個(gè)函數，可通過(guò)下列公式進(jìn)行計算：

• 誤差(%) = [(2ⁿ/(1+E)ⁿ) x 100)] – 100 (where E = PCR效率; n =循環(huán)數)

因此，如果PCR的效率不是1而是0.9，則25個(gè)循環(huán)之后結果誤差可達261%。計算出的基因表達水平將比實(shí)際值低3.6倍。

小貼士： ΔΔC_T法僅適于靶基因與內參基因的PCR效率相同時(shí)使用，或在基因表達水平之間的差異足夠大，可容忍結果誤差的情況下使用。不過(guò)，該誤差也可使用如Relative Expression Software Tool（REST；參見(jiàn)參考文獻5）一類(lèi)的效率校正計算程序進(jìn)行修正。

使用ΔΔC_T 法進(jìn)行相對定量的指南：

• 進(jìn)行有效性試驗，以確定靶基因和參考基因的PCR效率。
• 對源自不同樣本的RNA中的靶基因和參考基因進(jìn)行real-time RT-PCR。
• 通過(guò)將每一樣本中靶基因的C_T值減去內參基因CT值，以獲得ΔC_T值。
• 定義校驗樣品，通過(guò)使用每一樣品的ΔC_T值減去校驗樣品的ΔC_T值，以獲得ΔΔC_T值。
• 使用公式2^–ΔΔCT，來(lái)計算檢測樣品相對校驗樣本的靶基因表達水平的標準化數值。

內源性參比基因

為了對基因的表達進(jìn)行相對定量檢測，需要選取一個(gè)合適的基因做為對照。參比基因的表達水平應該在不同的實(shí)驗條件或者相同組織和細胞系的不同狀態(tài)下（比如，在疾病樣本和正常樣本中）維持恒定。對照RNA的表達水平應該與被研究的RNA大體一致。對照RNA經(jīng)常用于相對定量檢測?–肌動(dòng)蛋白、?–2–微球蛋白、親環(huán)蛋白A，GAPHD mRNA和18S rRNA等。廣泛表達的?–肌動(dòng)蛋白mRNA，是最早被用做參比基因的RNA之一。但是，它的轉錄水平可能會(huì )改變，并且由于假基因的存在，導致在real-time PCR中會(huì )檢測到基因組DNA，從而使得定量檢測不準確。GAPDH是一種看家基因，經(jīng)常被用做基因表達定量檢測的參比基因。GAPDH的mRNA的表達水平可能在不同的個(gè)體，細胞周期的不同階段以及不同藥物處理之后有差別，這使得GAPDH在有些體系中不適合用做參比基因。由于18S rRNA不是mRNA，它的表達水平不能準確的反應細胞內mRNA的數量。因此組合各種基因才有可能給定量檢測研究提供可靠的參照。

常用做內參基因的看家基因

* “+”轉錄本的相對豐度。

基因	人類(lèi)基因符號	小鼠基因符號	人類(lèi)的相對表達水平*	小鼠的相對表達水平*
18S ribosomal RNA	RRN18S	Rn18s	++++	++++
Actin, beta	ACTB	Actb	+++	+++
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase	GAPDH	Gapdh	+++	+++
Phosphoglycerate kinase 1	PGK1	Pgk1	+++	+++
Peptidylprolyl isomerase A	PPIA	Ppia	+++	+++
Ribosomal protein L13a	RPL13A	Rpl13a	+++	+++
Ribosomal protein, large, P0	RPLP0	–	+++	–
Acidic ribosomal phosphoprotein PO	–	Arbp	–	+++
Beta-2-microglobulin	B2M	B2m	++ to +++	++ to +++
Tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan5-monooxygenase activation protein, zeta polypeptide	YWHAZ	Ywhaz	++ to +++	+
Succinate dehydrogenase complex, subunit A, flavoprotein (Fp)	SDHA	Sdha	++	+
Transferrin receptor	TFRC	Tfrc	++	+
Aminolevulinate, delta-, synthase 1	ALAS1	Alas1	+	+
Glucuronidase, beta	GUSB	Gusb	+	+
Hydroxymethylbilane synthase	HMBS	Hmbs	+	++ to +++
Hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1	HPRT1	Hrpt1	+	+
TATA box binding protein	TBP	Tbp	+	+
Tubulin, beta	TUBB	–	+	–
Tubulin, beta 4	–	Tubb4	–	+

PCR對照

無(wú)模板對照

無(wú)模板對照(NTC)可以檢測PCR試劑是否被污染。一次NTC反應中包含了real-time PCR中除模板之外的所有成分。在NTC反應中檢測到陽(yáng)性信號說(shuō)明存在核酸污染物。

陽(yáng)性對照l(shuí)

陽(yáng)性對照很有必要，比如，在擴增一個(gè)新的目標序列時(shí)，它可用于確定引物集或者引物–探針集是否有效。陽(yáng)性對照可以是絕對標準品（即明確知道核酸模板的拷貝數目），以提供定量檢測的信息。從穩定細胞系中獲得的核酸、包含克隆序列的質(zhì)?；蛘唧w外轉錄的RNA等絕對標準品，可以通過(guò)商業(yè)渠道獲得或者在實(shí)驗室中制備。陽(yáng)性對照也可以是一個(gè)已知的陽(yáng)性樣本，通常用做絕對標準品的替代物，并且僅用于檢測靶標存在與否。

無(wú)RT對照

在進(jìn)行基因表達分析時(shí)，應該包含無(wú)RT對照實(shí)驗。無(wú)RT對照實(shí)驗是指，在做real-time PCR時(shí)不加入逆轉錄酶。對于病毒載量監測，根據樣本的類(lèi)型和該病毒物種的生命周期，無(wú)RT對照可能是必需的。由于無(wú)RT對照中，逆轉錄不可能發(fā)生，因此，無(wú)RT對照反應可以檢測到DNA污染物，比如整合到宿主基因組中的病毒DNA序列?？梢栽赗T-PCR之前，用脫氧核糖核酸酶處理樣本，以除去RNA樣本中的DNA雜質(zhì)。

內質(zhì)控

內在陽(yáng)性對照可以檢測到是否有PCR抑制劑存在。進(jìn)行一次雙重PCR反應，在這個(gè)反應中，目標序列使用一種引物–探針集擴增，而對照序列（即內部、陽(yáng)性對照）用其他引物–探針集擴增。為了得到精確的檢測結果，內在陽(yáng)性對照應該使用足夠多的拷貝數目。如果能檢測到內在陽(yáng)性對照的產(chǎn)物，但是卻檢測不到目標序列，則說(shuō)明擴增反應是成功的，目標序列并不存在（或者拷貝數目太低，不能被檢測到）。

有若干因素會(huì )導致假陰性結果，比如樣本提取錯誤或者熱循環(huán)儀故障。由于PCR或者RT-PCR被抑制導致實(shí)驗失敗是最常見(jiàn)的情況。

檢測抑制子是否存在的最可行方法是使用內在陽(yáng)性對照或內質(zhì)控（IC）。內質(zhì)控與待測病原體在同一離心管中同時(shí)純化和擴增（或僅被擴增），并且應與外部陽(yáng)性對照同時(shí)使用，以證明待測病原體擴增的反應混合液沒(méi)有異常。內質(zhì)控和外部陽(yáng)性對照的結合使用可排除抑制子因素，確保得到的陰性結果是準確的。

內質(zhì)控有多種類(lèi)型，每種適用于不同應用。內源性?xún)荣|(zhì)控在待測樣本中自然存在，例如宿主基因組中的一段序列（如β–actin）或是正常菌群基因組中的一段序列（如16s）。而外源性?xún)荣|(zhì)控是在核酸純化時(shí)或進(jìn)行PCR擴增之前加入樣本中的。

外源性?xún)荣|(zhì)控可以是同源的，人工構建的模板，具有一段和待測病原體相同的引物核酸序列。盡管使用相同的引物，但待測病原體和內質(zhì)控序列不同，因此可使用不同的探針區分病原體和內質(zhì)控擴增子。而異源內質(zhì)控是使用針對性的引物和探針檢測的。

內源性和外源性同源內質(zhì)控會(huì )競爭反應物，因此可能會(huì )影響檢測待測病原體的靈敏度。例如，高起始濃度的內源性?xún)荣|(zhì)控模板會(huì )影響檢測的靈敏度。起始濃度高可能是由特定樣本類(lèi)型或取樣技術(shù)導致的。進(jìn)行RNA相關(guān)研究時(shí)，可能是致病病原體過(guò)度導致的內質(zhì)控的高表達。對于外源性同源內質(zhì)控，因使用相同引物同時(shí)擴增待測病原體和內質(zhì)控，導致二者競爭引物。此外，內源性?xún)荣|(zhì)控和同源內質(zhì)控設計上具有冗余序列，所以?xún)H適用于個(gè)別檢測和應用。

至于操作安全性和工作流程簡(jiǎn)潔性，外源性異源內質(zhì)控應用最靈活、可提供最多信息。內質(zhì)控模板量是已知且統一的，并且其設計不受限制，可對各項屬性進(jìn)行優(yōu)化。只有使用外源性異源內質(zhì)控才可防止PCR反應物競爭，并且異源內質(zhì)控可作為通用對照，便利的用于新檢測。

內質(zhì)控的特點(diǎn)

特點(diǎn)	外源性同源	外源性異源	內源性
通用于多種assays	否	是	否
作為純化的對照	是	是	是
區分純化錯誤和擴增錯誤	是	是	否
模板量已知且一致	是	是	否
非競爭性?xún)荣|(zhì)控設計	否	是	是

PCR類(lèi)型

多重PCR

多重PCR在同一個(gè)反應中使用不同的引物對，以同時(shí)對多個(gè)目標序列進(jìn)行擴增。這種類(lèi)型的PCR通常需要充分優(yōu)化退火條件，以便對不同的引物–模板系統實(shí)現最高效率的擴增。這種類(lèi)型的PCR經(jīng)常受到非特異性PCR產(chǎn)物的影響。嚴格的熱啟動(dòng)程序和特別優(yōu)化的緩沖溶液系統對于成功的多重PCR絕對是非常關(guān)鍵的。

與僅使用兩個(gè)引物的標準PCR系統相比較，多重PCR所面對的另外一個(gè)挑戰是，不同的引物對之間，雜交動(dòng)力學(xué)性質(zhì)不同。結合效率更高的引物能更充分的利用PCR反應試劑，從而導致其它PCR產(chǎn)物的減少。這通常會(huì )導致一些本應該被擴增的產(chǎn)物沒(méi)有出現。有一些商業(yè)化的試劑盒經(jīng)過(guò)特別的設計，可以避免這種情況，條件允許時(shí)，建議盡量使用這一類(lèi)試劑盒。

長(cháng)片段PCR

低于4 kb長(cháng)的序列可以使用Taq DNA聚合酶和標準的PCR反應進(jìn)行擴增。但是，擴增長(cháng)度大于4 kb的序列，如果沒(méi)有經(jīng)過(guò)長(cháng)度優(yōu)化，通常會(huì )失敗。失敗的原因包括非特異性引物退火，DNA模板的二級結構，以及不理想的循環(huán)條件——所有這些因素對于長(cháng)片段擴增的影響要遠大于對短片段擴增的影響。防止DNA損傷，比如DNA脫嘌呤作用，對于長(cháng)片段的擴增是非常重要的，這是因為模板DNA上的一個(gè)單獨的損害就足以使PCR酶反應停頓?？梢允褂锰貏e的緩沖試劑，穩定反應的pH值，以將DNA在PCR循環(huán)中所受到的損害將到最低。一些商業(yè)化PCR試劑盒經(jīng)過(guò)特別的設計，比如，使用優(yōu)化過(guò)的Taq DNA聚合酶和校正讀碼酶的混合物，從而可以克服長(cháng)片段PCR所面對的問(wèn)題。條件允許時(shí)，建議盡量使用這一類(lèi)試劑盒。

單細胞PCR

單細胞PCR是一種使用有限的起始材料進(jìn)行基因鑒定的有價(jià)值的工具。通過(guò)使用流式細胞術(shù)或者顯微操作技術(shù)，能夠根據細胞表面的標志物或者其物理形態(tài)，將感興趣的單個(gè)細胞分離出來(lái)。低豐度模板分子擴增——有時(shí)候僅有一到兩個(gè)基因拷貝——要求PCR系統具有非常高的效率、特異性和靈敏性。同樣，市面上也有一些特別設計的針對單細胞PCR的商業(yè)化PCR試劑盒。

快速循環(huán)PCR

快速PCR擴增可以提高PCR的通量，使得研究者能將更多的時(shí)間用在下游的分析上。最新的快速PCR技術(shù)方面的發(fā)展縮短了得到結果所需要的時(shí)間。使用具有更高溫度變化速率的熱循環(huán)儀或者使用能顯著(zhù)縮短DNA變性、引物退火和DNA延伸所需的時(shí)間的新PCR試劑，以縮短循環(huán)時(shí)間，能夠實(shí)現快速PCR?？焖傺h(huán)PCR試劑必須經(jīng)過(guò)高度的優(yōu)化，以保證擴增的特異性和靈敏性。

甲基化特異性PCR（MSP）

在MSP中，使用亞硫酸氫鈉處理目標DNA，然后使用MSP確定其甲基化狀態(tài)。這種方法需要設計兩種引物集：一種引物集與未改變的胞嘧啶結合（即基因組DNA中甲基化的胞嘧啶），另外一種引物集與脲嘧啶結合，這些脲嘧啶是基因組DNA中未甲基化的胞嘧啶經(jīng)亞硫酸氫鹽處理轉化形成的。與未改變的序列配對的引物所得到的擴增產(chǎn)物，說(shuō)明其上的胞嘧啶是被甲基化了的，因此在用亞硫酸氫鹽的處理時(shí)沒(méi)有被改變。

必須使用嚴格的和高度特異性的PCR條件以避免非特異性引物結合以及人為的PCR擴增產(chǎn)物。由于將未甲基化的胞嘧啶轉變成脲嘧啶降低了DNA的復雜性并且增強了引物–模板的非特異性結合，因此這一點(diǎn)非常重要。

熱啟動(dòng)PCR

參見(jiàn)“熱啟動(dòng)DNA聚合酶”了解更多的信息。

高保真PCR

參見(jiàn)“高保真DNA聚合酶”了解更多的信息。

RAPD：快速擴增多態(tài)性DNA分析

RAPD是一種基于PCR的，分子水平生物體研究工具。這種方法使用小的，非特異性引物擴增基因組DNA上看似隨機的區域。在使用瓊脂糖凝膠電泳分析時(shí)，成功的引物對在不同的個(gè)體，菌種和物種上所得到的PCR產(chǎn)物，顯示不同的條帶模式。

在RAPD實(shí)驗中，引物的長(cháng)度僅有10個(gè)堿基左右。因此，退火溫度需要低于40°C。

RACE：cDNA末端的快速擴增

RACE是RT-PCR技術(shù)的一個(gè)變體，用來(lái)擴增mRNA模板的一個(gè)內部位點(diǎn)與其3’或5’末端之間的未知序列。RACE僅需要知道目標mRNA上的一段短的序列。這種技術(shù)通常用來(lái)克隆不完整的cDNA分子的剩余部分。有兩種RACE技術(shù)：

• 5' RACE——擴增cDNA的5'末端
• 3' RACE ——擴增cDNA的3'末端

兩種RACE技術(shù)的第一步一樣，都是使用逆轉錄酶將RNA轉化成單鏈的cDNA。區別在于第二步不同，兩種技術(shù)所得到的信息可以用來(lái)得到完整的cDNA序列。

由于RACE使用mRNA中的一個(gè)錨定位點(diǎn)作為參考位點(diǎn)，它有時(shí)候也被稱(chēng)作“錨定PCR”。

原位PCR

原位PCR技術(shù)是在玻片上的細胞內部進(jìn)行的PCR反應，這種技術(shù)綜合了PCR或者RT-PCR擴增的靈敏性與原位雜交技術(shù)。原位PCR技術(shù)能確定細胞的標志物并進(jìn)一步定位細胞群中（比如組織或者血液樣本中）的細胞特異性序列。因此，原位PCR是研究疾病進(jìn)展的強有力的工具。

在這種技術(shù)中，新鮮的和固定的細胞和組織樣本都能用，但是樣本制備對結果非常關(guān)鍵，并且細胞的固定對PCR信號有直接的影響。這種技術(shù)適合使用放射性標記的，熒光標記的或者生物素標記的核酸探針。

PCR的過(guò)程本質(zhì)上與標準的PCR過(guò)程相同，但是需要修改一些反應條件（比如Mg²⁺濃度）。

差異顯示PCR

差異顯示PCR是一種基于RT-PCR的技術(shù)，用來(lái)比較并確定兩個(gè)細胞系或者細胞群中mRNA（也就是基因）的表達模式的差異。

在這種技術(shù)中，通過(guò)使用與mRNA的poly(A)尾處的13個(gè)核苷酸以及轉錄序列上與之相鄰的兩個(gè)核苷酸互補的引物，引導第一條cDNA鏈合成。經(jīng)過(guò)逆轉錄和序列擴增之后，使用凝膠電泳觀(guān)測擴增產(chǎn)物。通過(guò)比較兩個(gè)細胞群的不同條帶模式，確定其所表達的cDNA的差異。

這種技術(shù)發(fā)明于20世紀90年代，并迅速成為基因表達分析領(lǐng)域的關(guān)鍵技術(shù)。但是最近這種技術(shù)更多的被RNA-seq、微陣列技術(shù)和qRT-PCR技術(shù)所取代。

RT-PCR準則

在進(jìn)行real-time RT-PCR時(shí)，必須仔細的選擇逆轉錄的酶和引物。引物要能逆轉錄所有感興趣的并且，并且逆轉錄酶所得到的cDNA的量必須能精確的反映原始RNA量，以便能精確定量檢測。除此之外，逆轉錄反應的成分對于后續的real-time PCR反應的影響要達到最小。

為以RNA為起始模板進(jìn)行PCR反應，必須通過(guò)逆轉錄反應(RT)將RNA逆轉錄成cDNA。RT和PCR可以在同一個(gè)試管中相繼完成（一步法RT-PCR），也可以分開(kāi)完成（兩步法RT-PCR）。一步法RT-PCR需要基因特異性的引物。

Real-time RT-PCR可以通過(guò)一步法或者兩步法完成。在兩步法PCR中，首先使用寡聚dT引物、隨機的寡聚物，或者基因特異性的引物，將RNA逆轉錄成cDNA。將逆轉錄反應產(chǎn)物分成若干等分，加入到real-time PCR反應中?？梢愿鶕?shí)驗的需要，選擇不同類(lèi)型的RT引物。使用寡聚dT引物或者隨機的寡聚物進(jìn)行逆轉錄反應，意味著(zhù)可以通過(guò)一個(gè)逆轉錄反應的產(chǎn)物，對幾個(gè)不同的轉錄本進(jìn)行PCR擴增和分析。除此之外，珍貴的RNA樣本可以立刻轉錄成更加穩定的cDNA，以用于后續的實(shí)驗或者長(cháng)期儲存。

在一步法RT–PC反應中——也被稱(chēng)為單管RT-PCR反應——逆轉錄和real-time PCR在同一個(gè)試管中進(jìn)行，逆轉錄反應先于PCR反應。特別的反應試劑和循環(huán)方案使之成為可能?？焖俚牧鞒炭梢匝杆俚奶幚矶鄠€(gè)樣本，并且易于實(shí)現自動(dòng)化。操作步驟的減少提高了不同樣本結果的可重復性，并且由于減少了操作，降低了樣本被污染的風(fēng)險。

不同的RT-PCR操作流程的優(yōu)勢

操作	優(yōu)勢
兩步法RT-PCR	多重PCR進(jìn)行一個(gè)RT反應 RT引物選擇靈活 可長(cháng)期儲存cDNA
一步法RT-PCR	操作簡(jiǎn)便 流程快速 可重復性高 污染可能性小

RT引物的選擇

逆轉錄反應選取什么樣的引物取，決于進(jìn)行的是一步法還是兩步法RT-PCR。在一步法RT-PCR中，下游PCR反應的引物即為逆轉錄的引物。因此，一步法RT-PCR一定要使用基因特異性引物。在兩步法RT-PCR中，可以使用三種不同類(lèi)型的引物以及它們的混合物，它們分別是寡聚dT引物（通常包含13–18個(gè)核苷酸），隨機的寡聚物（比如六聚物，八聚物或者九聚物），或者基因特異性的引物。如果使用寡聚dT引物，僅mRNA能從其3'末端的poly–A的尾巴處逆轉錄。隨機的寡聚物能夠逆轉錄所有的RNA，包括核糖體RNA，轉運RNA，和核內小分子RNA。由于逆轉錄是從RNA分子中間的某些位點(diǎn)上開(kāi)始的，因此，這將得到相對較短的cDNA分子。而基因特異性的引物可以逆轉錄某一特定轉錄本。

兩步法real-time RT-PCR中的逆轉錄反應中，采用通用引物應該就能高靈敏度、可重復的擴增和檢測任何PCR產(chǎn)物，不受長(cháng)度和擴增子的位置限制。

RT-PCR應用中引物類(lèi)型的適用性

應用	推薦的引物類(lèi)型
特定轉錄本的RT-PCR	基因特異性的引物具有最高的靈敏性，并且只逆轉錄所選定的RNA分子
長(cháng)擴增子的RT-PCR	寡聚dT引物或者基因特異性引物
長(cháng)轉錄本中的擴增子的RT-PCR	推薦基因特異性引物，隨機的寡聚物，或者寡聚dT引物和隨機九聚體的混合物，這樣可以得到覆蓋完整轉錄本的cDNA

兩步法RT-PCR的條件

加入到兩步法RT-PCR中的RT反應溶液的體積的影響

在兩步法RT-PCR中，加入到后續的擴增反應中的逆轉錄反應溶液中的，不僅包含了cDNA，還包含了鹽、dNTP和逆轉錄酶。逆轉錄反應的緩沖液，與real-time PCR緩沖液的鹽成分不同，因此會(huì )損害real-time PCR的效果。但是，如果RT反應溶液的體積占最終的real-time PCR體積的10%或者更少，這種損害就不那么明顯。如果20 μl的PCR反應溶液中包含了3 μl的RT反應溶液（即總體積的15%），那么real-time PCR反應就會(huì )被顯著(zhù)抑制。我們建議測試下逐漸稀釋的RT反應溶液對real-time PCR反應的影響，以確定這種影響的線(xiàn)性關(guān)系。這可以幫助消除RT反應混合物對PCR的抑制作用，以免影響對轉錄本的精確定量檢測。

RNA二級結構的影響

RNA的二級結構能從幾個(gè)不同的方面影響RT-PCR。具有復雜結構的RNA區域會(huì )終止逆轉錄酶的作用或者使其從RNA模板上解離出來(lái)。

截斷的cDNA片段由于缺失下游的引物結合位點(diǎn)，不能被PCR反應所擴增。而逆轉錄酶可能跳過(guò)RNA的環(huán)狀區域，這樣，在合成的cDNA中就不包含這段序列。在PCR反應中，這些缺失中間序列的cDNA被擴增，并產(chǎn)生了縮短的PCR產(chǎn)物。理想狀況下，逆轉錄酶應該不受RNA二級結構的影響，并且能夠逆轉錄任何模板，而不需要反應優(yōu)化。

如果序列中的GC含量較高，那么RNA：DNA所形成的雜交物會(huì )結合的非常緊密，并且會(huì )影響PCR反應中的引物結合，阻止DNA聚合酶的作用。RNase H可以去除RNA：DNA雜交物中的RNA，方便引物結合和第二條DNA鏈合成。以前的研究顯示，RNase H能夠改善RT-PCR的產(chǎn)量，并且對于擴增某些序列是必須的——即使是157 bp的短序列（7）。

一步法RT-PCR的條件

一步法RT-PCR中理想的逆轉錄酶，應該與前述兩步法RT-PCR中的逆轉錄酶有相同的性質(zhì)。但是一步法RT-PCR中的一個(gè)主要問(wèn)題是，逆轉錄酶對于PCR反應的抑制作用。這會(huì )導致C_T值增大，從而使得其靈敏性和特異性不如兩步法RT-PCR。

RT-PCR引物設計

RT-PCR中的一個(gè)關(guān)鍵因素是，選擇合適的引物以達到最高的效率和最大的特異性。引物的特異性受到很多因素的影響，包括序列、引物的位置和使用的RT-PCR體系。常規PCR實(shí)驗的引物設計規則也適用于RT-PCR，可避免錯誤引導或者引物二聚體的形成。這些設計規則在RT-PCR中可能更加重要，這是由于逆轉錄得到的cDNA是單鏈，更容易與引物非特異性結合。RT-PCR反應中，引物非特異性的結合會(huì )降低反應的靈敏度，導致特定產(chǎn)物減少，甚至整個(gè)RT-PCR反應失敗。

為了避免擴增基因組DNA，可以這樣設計RT-PCR的引物：引物的一端與一個(gè)外顯子的3’端雜交，另一端與相鄰外顯子的5’端雜交。這樣的引物在退火時(shí)，與剪接后的mRNA逆轉錄得到的cDNA雜交，而不與基因組DNA雜交。

為了測定DNA污染物是否被擴增了，在設計RT-PCR的引物時(shí)，應使其覆蓋的區域包含至少一個(gè)內含子。從cDNA（不包含內含子）擴增得到的產(chǎn)物，比從基因組DNA（包含內含子）擴增得到的產(chǎn)物要短。產(chǎn)物尺寸上的差別可以檢測DNA污染物是否存在。

如果僅mRNA序列已知，請選擇相隔至少300–400 bp核的引物退火位點(diǎn)。因為真核DNA上，這種尺度的片段可能包含剪接位點(diǎn)。如前所述，這樣的引物可以用來(lái)檢測DNA污染物存在與否。

總的說(shuō)來(lái)，在設計RT-PCR的引物時(shí)，需要考慮如下因素：

• 退火溫度會(huì )影響RT-PCR的效率和靈敏性。
• 高引物濃度會(huì )導致錯誤引導和引物二聚體的形成。
• 嚴格的熱啟動(dòng)流程對于得到最佳的RT-PCR結果的必備條件。
• RT-PCR引物設計應使其能夠區別出RNA和DNA污染物的信號。為了得到最好的結果，應該使用不含DNA的RNA以避免RT-PCR反應中DNA參與競爭。

RT-PCR中使用的酶

RT-PCR將逆轉錄和PCR聯(lián)合起來(lái)，以分析RNA。使用逆轉錄酶以RNA為模板合成cDNA——RNA依賴(lài)的DNA聚合酶，通常從多種逆轉錄病毒中提取出來(lái)（比如禽類(lèi)成髓細胞瘤病毒 [AMV]或者莫洛尼鼠類(lèi)白血病病毒 [MMLV] ）。

盡管熱力學(xué)穩定的DNA聚合酶，比如Tth DNA聚合酶，在特定的條件下也具有逆轉錄酶的活性，但是這些酶不如中溫逆轉錄酶高效。

在較低溫度下，逆轉錄反應生成的單鏈cDNA比雙鏈DNA（基因組DNA）更容易與引物非特異性的結合。非特異性的退火會(huì )導致擴增的特異性較差，特別是在有限的cDNA的數量和低豐度的轉錄本的情況下，會(huì )降低反應的靈敏性和可重復性。擴增的特異性對于成功的RT-PCR是至關(guān)重要的，這可以通過(guò)同時(shí)使用包含特別修飾過(guò)的逆轉錄酶的新型的緩沖溶液和熱啟動(dòng)PCR實(shí)現。

多重PCR和RT-PCR

在多重real-time PCR中，可以在同一個(gè)反應中同時(shí)定量檢測幾個(gè)基因組靶標DNA。多重real-time RT-PCR是一組類(lèi)似的方法，用于在同一組反應中同時(shí)定量檢測幾個(gè)不同的RNA靶標。具體操作時(shí)，既可以采用兩步法RT-PCR，也可以采用一步法RT-PCR。

多重PCR和RT-PCR在很多應用中有巨大的優(yōu)勢，比如基因表達分析，病毒載量檢測和基因分型檢測。目標基因和內質(zhì)控在同一個(gè)反應中被同時(shí)擴增，以避免單獨擴增時(shí)各個(gè)反應小孔之間的差異。內質(zhì)控可以是不同的樣本中，沒(méi)有表達差異的內源性基因（比如看家基因），也可以是外部的核苷酸序列。對于病毒載量檢測而言，使用外源性的核酸作為內質(zhì)控，可以檢測樣本的準備是否成功，抑制劑存在與否以及PCR是否成功。多重分析可以非常高的精度對基因進(jìn)行相對定量檢測，其中目標基因的數量根據對照組的參比基因的數量進(jìn)行標準化。在一個(gè)反應中，對多個(gè)基因定量檢測減少了試劑的使用，節省了珍貴的樣本材料，并且提高了通量。

可以用光譜相距較遠的熒光染料和適當的淬滅基團標記基因特異性探針，此類(lèi)探針使得多重PCR和RT-PCR成為可能。這意味著(zhù)染料的最大發(fā)射波長(cháng)必須被明確分離，并且彼此之間不能重疊。除此之外，反應必須在支持多重分析的，適當的real-time擴增儀中進(jìn)行（即在同一個(gè)小孔或者試管中激發(fā)并檢測幾種不重疊的染料）。

全轉錄組擴增(WTA)

全轉錄組擴增(WTA)可采用非常少量的RNA，對整個(gè)轉錄本進(jìn)行擴增，從而可以用real-time RT-PCR技術(shù)對轉錄本進(jìn)行無(wú)限制的分析。RNA樣本的全轉錄本擴增首先使用逆轉錄反應生成cDNA，并將cDNA連接，最終使用多重置換擴增技術(shù)(MDA)進(jìn)行擴增。

當僅有ng級的RNA樣本時(shí)，所能進(jìn)行的real-time RT-PCR分析的數目是非常有限的。這一問(wèn)題可通過(guò)WTA解決。這種技術(shù)中，一個(gè)RNA樣本中所有的mRNA轉錄本都被復制了，以得到mg級別的cDNA模板。這些cDNA足夠進(jìn)行不受限制的real-time PCR分析，并得到穩定的結果。

WTA技術(shù)

為了得到可靠的real-time PCR 結果，WTA方法需要能夠無(wú)偏且準確的擴增整個(gè)轉錄本。這意味著(zhù)每一個(gè)轉錄本的序列和相對豐度在WTA實(shí)驗中都保留下來(lái)，否則基因表達分析會(huì )得到錯誤的結果。

逆轉錄反應使用了隨機的寡聚物和寡聚dT作為引物，構建了覆蓋所有轉錄序列（包括3’端和5’端）的cDNA文庫。將這些cDNA連接起來(lái)，并且使用MDA技術(shù)，通過(guò)獨特的進(jìn)行性DNA聚合酶得到擴增后的cDNA。這些cDNA保留了初始RNA樣本中的轉錄本呈遞信息。這對于精確的基因表達分析非常重要。

在進(jìn)行WTA實(shí)驗時(shí)，同時(shí)考慮起始材料量（即細胞的數量或者RNA的數量）和感興趣轉錄本的拷貝數目是非常重要的。表“不同細胞數量的轉錄本”顯示了起始材料量與轉錄本呈遞之間的關(guān)系（注意這僅作為指導：每一定量檢測的起始材料的轉錄本數量可能會(huì )變化）。如果起始材料中，轉錄本的拷貝數目低于10（在表中用粗體顯示），可能會(huì )發(fā)生隨機性的問(wèn)題（即非常低數量的轉錄本在高度稀釋的溶液中的不均勻分布）。這可能會(huì )在WTA的開(kāi)始階段，導致低拷貝轉錄本的數量被低估。對于嵌合轉錄本應該特別考慮。嵌合轉錄本是由僅在組織的一部分細胞中表達的基因轉錄而成的。由于這些轉錄本不是在每一個(gè)細胞中都存在，因此在較低的起始材料量的情況下（比如1–10²個(gè)細胞），它們不能被精確測定。

可靠的WTA取決于轉錄本的拷貝數目。10 ng的DNA相當于500個(gè)細胞，在這種情況下，即使低拷貝數目的轉錄本也能被準確的測定。使用更少的RNA或者非常有限數目的細胞，意味著(zhù)起始材料中可能會(huì )缺失低拷貝轉錄本，或者僅包含部分低拷貝轉錄本。

不同細胞數量的轉錄本

*含有各種轉錄本。
^?隨機的mosaic轉錄本。
^?隨機的低拷貝和mosaic轉錄本。 
^§隨機的低拷貝轉錄本，mosaic轉錄本有丟失。

參數	103個(gè)細胞*	103個(gè)細胞?	10個(gè)細胞?	1個(gè)細胞§
RNA量 (ng)	20	2	0.2	0.02
高拷貝轉錄本的數量	107	106	105	104
中等拷貝轉錄本的數量	105	104	103	102
低拷貝轉錄本的數量	103	102	10	1
mosaics轉錄本的數量	102	10	1	0

DNA污染

去除DNA污染

如果PCR的引物也能擴增基因組DNA序列，RNA樣本中痕量基因組DNA的污染會(huì )干擾real-time RT-PCR的定量檢測。為了避免基因組DNA污染的負面影響，需要仔細的設計引物。如果這不能實(shí)現，應該使用DNase I處理RNA樣本，以降解掉DNA污染物。

檢測RT-PCR中的DNA污染

使用合適的對照可以檢測到RT-PCR中的任何DNA污染物。應分別在逆轉錄酶存在和不存在的情況下進(jìn)行反應。如果在不存在逆轉錄酶的情況下出現了產(chǎn)物，則說(shuō)明樣本中存在DNA污染物。

參考文獻

Bustin, S.A., ed. (2004) A-Z of Quantitative PCR. La Jolla, CA: International University Line.

引用文獻

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