動(dòng)物細胞培養

按照動(dòng)物細胞的來(lái)源將其培養于單層貼壁或懸浮條件下。

貼壁細胞需固著(zhù)生長(cháng)，在細胞培養容器內表面形成一層單細胞粘附層。這種粘附對于細胞增殖是必要的——許多貼壁細胞一旦相互接觸便停止增值（例如在它們完全覆蓋細胞培養容器表面的時(shí)候），并且如果相互接觸時(shí)間過(guò)長(cháng)，其中的一部分還會(huì )死去。來(lái)源于組織的大部分細胞都是固著(zhù)生長(cháng)的。

懸浮細胞無(wú)需粘附于基質(zhì)即可生存和增殖。造血細胞（源于血液、脾臟或骨髓）以及一些轉化細胞系和源于惡性腫瘤的細胞能夠在懸浮狀態(tài)下生長(cháng)。

原代細胞、有限細胞系和傳代細胞系的增殖潛力各不相同。不同的細胞類(lèi)型之間生長(cháng)行為和營(yíng)養需求上的差異很大。對細胞培養條件的優(yōu)化是必要的，這樣能夠確保細胞健康生長(cháng)，并在最適條件下引入后續應用。

在參考資料1中可以獲得關(guān)于細胞培養的詳盡資料。

原代細胞培養

原代細胞培養物源自于組織塊中長(cháng)出的遷移細胞，或使用酶、化學(xué)試劑或機械法解離出的組織細胞。原代培養物是由組織解聚處理后存活下來(lái)的細胞所組成，它們粘附于細胞培養容器表面（或存活于懸浮相中）并進(jìn)行增殖。

原代細胞的形態(tài)類(lèi)似于它們的來(lái)源組織。這些培養物能夠分裂有限代，隨后進(jìn)入一個(gè)稱(chēng)為衰老的非增殖狀態(tài)，并最后死去。貼壁型原代細胞對于接觸抑制十分敏感，即它們一旦相互匯合就停止生長(cháng)。但當細胞密度較低時(shí)，正常表型就可以維持。原代細胞的培養一般比傳代細胞系更為困難。

不過(guò)在某些時(shí)候人們在實(shí)驗系統中更傾向于使用原代細胞培養物而非傳代細胞系。這是因為原代細胞被許多研究者視為更接近于活體細胞的生理特性。此外，細胞系培養時(shí)間過(guò)長(cháng)可能導致其表型和遺傳型的改變，導致同一細胞株系在不同實(shí)驗室中出現結果差異。而且，許多細胞類(lèi)型無(wú)法建立傳代細胞系。

有限細胞系

有限細胞系是由原代細胞培養物的第一次亞克?。▊鞔┧纬傻呐囵B物。這些培養物以有限的世代進(jìn)行分裂增殖，之后開(kāi)始衰老。一些人類(lèi)有限細胞培養物的增殖潛力可以通過(guò)使用病毒轉化基因（例如SV40轉化——抗原基因）的導入進(jìn)行延長(cháng)。這些培養物的表型介于有限培養物和連續培養物之間。這些細胞會(huì )在一定的延長(cháng)時(shí)間內增殖，不過(guò)通常它們最后會(huì )停止分裂，與老化的原代細胞類(lèi)似。這類(lèi)細胞在某些情況下比原代細胞培養物更容易操作，特別是對于穩定轉染的克隆而言。

傳代細胞系

有限細胞培養物最后將死去，或者獲得穩定可遺傳的突變從而變?yōu)檫B續傳代細胞系，形成無(wú)限增殖的能力。這一改變通常被稱(chēng)之為體外轉化或永生化，與腫瘤發(fā)生學(xué)密切相關(guān)。

無(wú)論是自然發(fā)生還是暴露于誘變劑進(jìn)行人工，誘導嚙齒類(lèi)動(dòng)物的原代細胞培養物都能夠相對容易地形成連續傳代的細胞系。與此相反，人類(lèi)的原代細胞培養物很少以此類(lèi)方式形成永生化（如果有過(guò)的話(huà)），并需要額外賦予遺傳操作，才能形成連續傳代細胞系。不過(guò)，源于人類(lèi)腫瘤的細胞培養物經(jīng)常是可不斷增殖的。

連續傳代細胞系通常比原代細胞或有限細胞系更容易操作。不過(guò)，應記住這些細胞的遺傳已發(fā)生了改變，其體外行為有可能與在活體內有所區別。

動(dòng)物細胞培養物的安全性和操作注意事項

法規和監管指南

在操作任何動(dòng)物或人體組織（例如建立原代細胞培養物）之前，有必要確保該項工作的屬性符合醫學(xué)倫理學(xué)和動(dòng)物實(shí)驗的相關(guān)法規和準則?？赡苄柘蛴嘘P(guān)監管部門(mén)和/或個(gè)人尋求批準。

安全考慮與生物危害

當操作潛在的有害物質(zhì)時(shí)，對材料或實(shí)驗方案中可能存在的危害具有充分的認識十分重要。所有的細胞培養物都可能存在生物危害，因為它們都潛在地包含了傳染物（例如病毒）。

其危險程度取決于所使用的具體細胞種類(lèi)和實(shí)驗方案。對于原代細胞培養物應特別小心地進(jìn)行操作，因為這些培養物在帶有未知病毒方面具有很高風(fēng)險。盡管常用細胞系一般被認為不含傳染物，但操作時(shí)仍需小心，因為它們還是可能含有如潛伏性病毒一類(lèi)的傳染物。用于研究特定病毒的細胞培養物，應假定其具有包含目的病毒時(shí)的同等危險程度。

我們建議將所有的實(shí)驗材料按照潛在感染的標準進(jìn)行操作，以此確保人們在最為安全的環(huán)境下工作。實(shí)驗流程應在經(jīng)驗證的層流凈化罩下，使用無(wú)菌技術(shù)進(jìn)行操作，并避免氣溶膠的產(chǎn)生。工作完成后，所有的廢棄物和儀器（例如用過(guò)的燒瓶、槍頭等）應該按照單位和地方的標準，通過(guò)高壓滅菌法或在適當消毒劑中浸泡進(jìn)行消毒。

處理細胞培養物

當對細胞培養物進(jìn)行操作時(shí)，堅持良好的實(shí)驗室操作規范是必要的，這主要有兩個(gè)原因：首先，可以減少操作者被潛在傳染物（可能不只一種）感染的風(fēng)險；其次，避免細胞被細菌或其他動(dòng)物細胞污染。

使用無(wú)菌操作技術(shù)和減少氣溶膠的產(chǎn)生

正確使用實(shí)驗室設備并進(jìn)行無(wú)菌操作，在對細胞培養物的研究中是必需的。在開(kāi)始工作之前，務(wù)必使用消毒過(guò)的儀器和試劑，并使用殺菌劑或70%乙醇清洗手、試劑瓶和工作臺表面。

應避免氣溶膠的產(chǎn)生，因為其存在吸入性危害，并可能導致培養物之間發(fā)生潛在的交叉污染。為了避免氣溶膠的產(chǎn)生，請使用TD型（移液）的槍頭，而不要使用TC型（存液）槍頭；使用帶有棉花塞的槍頭；避免對液體進(jìn)行快速的上下混合；不要過(guò)度用力地吹去槍頭中的液體；使用槍頭操作液體時(shí)盡量避免氣泡的產(chǎn)生。避免從過(guò)高的位置向接受容器中吹出槍頭中的液體。吹出液體時(shí)槍頭盡可能靠近接收容器的頁(yè)面，或使液體沿容器側壁流下。

正確使用設備能有助于最大程度地減少氣溶膠產(chǎn)生的風(fēng)險。例如在使用離心機的時(shí)候，確保被離心的試管都被正確地密封，從而避免在管頂部產(chǎn)生液滴；使用帶蓋的離心機并密封其頂部以隔絕氣溶膠污染。

層流凈化罩

為了確保操作的最高效率，層流凈化罩應位于實(shí)驗室內最少受空氣擾動(dòng)影響的區域。避免在靠近門(mén)口、通風(fēng)口或密集活動(dòng)的位置放置層流凈化罩。一般在專(zhuān)用的細胞培養室中放置層流凈化罩。

小技巧：

• 請保持層流凈化罩的潔凈，并避免在罩內放置器材。
• 在開(kāi)始操作之前，清洗罩內的工作表面以及每個(gè)瓶子的外表面（例如使用70%乙醇進(jìn)行擦拭），之后將所有細胞培養的實(shí)驗所需材料放置于罩內。
• 擺好儀器、槍頭、廢液缸和試劑瓶，讓使用過(guò)的物品遠離潔凈物品，并避免一切將用過(guò)的物品經(jīng)過(guò)潔凈物品上方的操作。
• 將用過(guò)的物品（例如槍頭）放在罩內的一個(gè)特定容器中，從罩內取出之前進(jìn)行消毒或密封。

污染

微生物的存在可能抑制細胞生長(cháng)和死亡，導致結果不一致。細胞培養的污染在新手和熟手身上均可能發(fā)生。

潛在的污染途徑是多種多樣的。不潔操作即可造成培養物污染，來(lái)源可能是被污染的培養基、試劑和器材（例如槍頭），或培養箱、冰箱和層流凈化罩中的微生物，也可能是操作者的皮膚或來(lái)源于其他實(shí)驗室的培養物。

細菌、酵母、真菌類(lèi)、霉菌、支原體及其他細胞培養物是動(dòng)物細胞培養物中常見(jiàn)的污染物。為了預防發(fā)生污染造成細胞培養物的損失，我們建議凍存一部分培養細胞，這樣在必要的情況下可以重新培養。

微生物污染

微生物污染的特征請參見(jiàn)表 微生物污染的特征。某些情況下傳染物的存在可以通過(guò)培養物的渾濁，或培養基pH值的急劇改變（通常培養基的指示劑顏色會(huì )發(fā)生改變）以及細胞培養物的死亡判定。不過(guò)，某些污染不會(huì )造成培養物的渾濁，其不良影響也并不容易被發(fā)現。

細胞培養物應常規進(jìn)行污染物的鑒定。支原體感染是比較常見(jiàn)并難以檢測的感染物之一；對它們的檢測和消除進(jìn)一步詳細描述如下。

微生物污染的特點(diǎn)

特點(diǎn)	細菌	酵母	真菌
pH的變化	多數感染導致pH值下降	嚴重感染導致pH值改變	有時(shí)pH值變化
介質(zhì)渾濁：在顯微鏡下（100–400x）	細胞之間有閃光；可能觀(guān)察到桿菌或球菌	圓形或橢圓形能夠產(chǎn)生更小顆粒	細絲狀菌絲體；有時(shí)有孢子團

支原體感染與檢測

支原體是一類(lèi)生長(cháng)緩慢的微小原核生物，它們缺少細胞壁，經(jīng)常污染細胞培養物。它們不像細菌和真菌那樣受抗生素影響。而且，支原體不會(huì )長(cháng)滿(mǎn)整個(gè)培養容器，也不會(huì )造成培養物的渾濁。它們可能長(cháng)期存在而不被察覺(jué)，很容易擴散到其他的細胞培養物當中。支原體污染的不良后果包括抑制細胞的代謝和生長(cháng)，也會(huì )干擾核酸合成和細胞的抗原性。急性感染會(huì )導致整個(gè)細胞培養物的退化，有時(shí)出現一些明顯的抗性克隆，但其實(shí)也被緩慢感染。檢驗支原體的存在主要由兩種方法——Hoechst 33258染色（1,3）和支原體特異性的DNA探針。另外，ATCC或其他組織也提供基于PCR的支原體檢測收費服務(wù)。

支原體感染的消除

最好的辦法是通過(guò)高壓滅菌或焚燒的方式，放棄使用被支原體慢性污染的培養物。只有當培養物絕對無(wú)法替代的時(shí)候才嘗試對其進(jìn)行消除。這一步驟應由經(jīng)驗人士在隔離的超凈臺中進(jìn)行操作，最好該超凈臺位于一個(gè)獨立房間，并且不用于細胞培養操作。支原體的消除一般是通過(guò)使用多種市售抗生素來(lái)完成的，可使用的試劑包括喹諾酮衍生物（Mycoplasma Removal Agent，支原體去除試劑），環(huán)丙沙星（Ciprobay），恩諾沙星（Baytril），以及泰妙菌素和米諾環(huán)素（BM–Cyclin）的混合物。處理步驟和適當的抗生素濃度參見(jiàn)廠(chǎng)商說(shuō)明書(shū)以及參考資料1和3。

細胞系的交叉污染

對一種細胞培養物而言，存在著(zhù)被另一種快速生長(cháng)的細胞（例如Hela細胞）交叉污染的嚴重風(fēng)險。為了避免交叉污染的發(fā)生，請使用正規細胞庫提供的細胞系；同一時(shí)間內只在超凈臺內操作單一細胞系；針對不同的細胞系使用不同的槍頭、試劑瓶和培養基容器；定期檢查細胞，確保其具有正常的形態(tài)和生長(cháng)特點(diǎn)。

細胞培養條件

培養基和血清

細胞培養基的選擇極為重要，能夠對細胞培養實(shí)驗的成功與否造成顯著(zhù)影響。不同細胞類(lèi)型具有各自特異性的生長(cháng)需求，對于每種細胞類(lèi)型的最適培養基需要通過(guò)試驗確定。常見(jiàn)的基礎培養基包括Eagle極限必需培養基（MEM）、Dulbecco改良型Eagle培養基（DMEM）、RPMI 1640培養基和Ham F10培養基。它們都是包含氨基酸、葡萄糖、鹽分、維生素及其他營(yíng)養成分的混合物，市面上有多家廠(chǎng)商供應粉末或液體形式的這類(lèi)培養基。

基礎培養基通常在使用前加入血清、L型谷氨酰胺、抗生素和/或殺真菌劑，以配成完全培養基（成為生長(cháng)培養基）。血清是一類(lèi)包含生長(cháng)和粘附分子的原料，成分并不完全清楚，對不同特定細胞類(lèi)型生長(cháng)方面的支持能力也差異很大。胎牛血清(FCS)是最為常用的血清，但對于某些應用來(lái)說(shuō)，可使用更便宜的馬血清或小牛血清。不同批次的血清應單獨進(jìn)行測試，以便找出對于特定細胞類(lèi)型最為合適的一種。L型谷胱甘肽是一類(lèi)不穩定的氨基酸，隨時(shí)間逐漸轉變成細胞無(wú)法利用的形式，因此應在使用前加入培養基?？股睾蜌⒄婢鷦┳鳛闊o(wú)菌技術(shù)的添加物，用來(lái)阻止微生物污染。常用抗生素和殺真菌劑的工作濃度請參見(jiàn)表 動(dòng)物細胞培養的常用抗生素和動(dòng)物細胞培養的常用殺真菌劑。某些細胞類(lèi)型，特別是一些原代細胞，需要額外的添加劑（例如膠原和纖連蛋白、如雌激素一類(lèi)的荷爾蒙，以及如表皮生長(cháng)因子和神經(jīng)生長(cháng)因子一類(lèi)的生長(cháng)因子）幫助細胞成功貼壁和增殖。

培養基、血清和添加物在使用前，應于37°C下孵育48小時(shí)以進(jìn)行消毒測試。如果孵育后發(fā)生了微生物的生長(cháng)，該培養基和添加物應當棄之不用。

動(dòng)物細胞培養的常用抗生素

來(lái)自參考文獻4。

抗生素	工作濃度	作用微生物	在37°C的穩定狀況
青霉素	50–100 U/ml	革蘭氏陽(yáng)性菌	3天
鏈霉素	50–100 μg/ml	革蘭氏陰性菌	5天
卡那霉素	100 μg/ml	革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細菌；支原體	5天
慶大霉素	5–50 μg/ml	革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細菌；支原體	5天

用于動(dòng)物細胞培養的常用殺菌劑

來(lái)自參考文獻4。

抗體	工作濃度	作用微生物	在37°C的穩定狀況
制霉菌素	100 U/ml	霉菌和酵母菌	3天
兩性霉素B	0.25–2.5 μg/ml	霉菌和酵母菌	3天

孵育條件

培養細胞的孵育條件也同樣重要。細胞培養物應該在對溫度（如隔水式培養箱）和二氧化碳濃度具有嚴謹控制的培養箱中進(jìn)行孵育。大多數細胞系需要在37°C和5% CO₂的飽和濕度條件下生長(cháng)，但某些細胞類(lèi)型需要較低的溫度和/或較低的CO₂濃度。

細胞培養容器

培養容器的選擇可能會(huì )對貼壁細胞的生長(cháng)產(chǎn)生影響。市面上可以買(mǎi)到表面經(jīng)過(guò)處理的無(wú)菌一次性培養皿和培養瓶，其處理過(guò)的表面能夠保證動(dòng)物細胞在上面良好地生長(cháng)。

細胞庫

對于某些細胞培養物，尤其是那些重要類(lèi)型而言，比較常用的做法是保存于一個(gè)雙份冷凍細胞庫：一個(gè)主細胞庫和一個(gè)工作細胞庫。工作細胞庫包含了主細胞庫中的細胞樣本，它們在儲存之前已經(jīng)培養生長(cháng)了數代。如果需要調用該細胞樣本，就從工作細胞庫中取用。主細胞庫只有絕對必要時(shí)才會(huì )使用。這能夠確保所保存原始細胞的分裂數達到最低，并避免其在培養過(guò)程中發(fā)生遺傳變異。

培養物的不穩定性

重復進(jìn)行傳代培養的細胞的生長(cháng)率有時(shí)會(huì )發(fā)生不可預期的減少，而如轉染過(guò)程等操作過(guò)程中的細胞毒性又會(huì )意外增加。這種不穩定性可歸因于細胞培養條件的變化，基因組變異以及細胞群體中某一組分選擇性的過(guò)度生長(cháng)。我們推薦使用低傳代數的細胞（少于十個(gè)分裂周期）。為了預防在連續傳代細胞系中發(fā)生不穩定的現象，避免有限細胞系中發(fā)生衰老或轉化作用，并在轉染實(shí)驗中保證一致性，我們建議通過(guò)凍存一部分細胞建立細胞庫，以便在可能的必要時(shí)刻重新進(jìn)行復蘇培養。

動(dòng)物細胞培養的基本方案

細胞培養物的維持

建立和維持動(dòng)物細胞培養物需要在培養基的配制、加入和傳代過(guò)程當中使用標準化的操作。培養物需定期檢查污染情況，并決定是否需要繼續換液和傳代。

下列細胞培養規程來(lái)源于下列資料：動(dòng)物細胞培養：基本技術(shù)手冊（Manual of Basic Technique，[1]），當今分子生物學(xué)實(shí)驗方案（Current protocols in Molecular Biology [4]），和細胞：實(shí)驗室手冊（Cells :a Laboratory Manual [2]）。這些方案是對于普通細胞培養方法的實(shí)例，并沒(méi)有被QIAGEN進(jìn)行嚴格確證和優(yōu)化。目前也存在許多正在使用中的替代方案。

重要：具有潛在生物危害性的材料（如細胞、培養基等）應在廢棄前進(jìn)行消毒處理，并按照您所在機構的相關(guān)準則進(jìn)行丟棄。

細胞復蘇

1. 在37°C水浴中進(jìn)行加熱，并預熱細胞所需的生長(cháng)培養基。
2. 將預熱的生長(cháng)培養基加入適當大小的細胞培養容器中。
3. 從液氮中取出一小瓶?jì)龃婕毎?，并放置于水浴中直至解凍?br /> 重要：解凍液氮中儲存的凍存管時(shí)請佩戴護目鏡和手套。小管從液氮中取出時(shí)可能會(huì )炸裂。
   重要：細胞一旦解凍，立即進(jìn)入第4步。將它們移至生長(cháng)培養基之前不要讓細胞變暖。
4. 使用70%乙醇或其他適當的消毒劑清洗凍存管外表面。
5. 輕柔吸取已解凍的細胞懸液，將其移至包含已預熱生長(cháng)培養基的細胞培養容器中。輕輕渦動(dòng)容器使細胞與培養基充分混合。
   注意：某些情況下需立即除去DMSO，特別是對于懸浮細胞、原代細胞和敏感的細胞類(lèi)型而言。在此種情況下，將解凍的細胞懸液吸入包含預熱培養基的無(wú)菌離心管當中，在200 xg下離心2分鐘，去除上清液并在新鮮的生長(cháng)培養基中重懸細胞沉淀，之后再移至適當的細胞培養容器中。 
   重要：在細胞培養容器中徹底混勻細胞，確保其在整個(gè)容器內分布均勻。
6. 將細胞在其常用的生長(cháng)條件下孵育過(guò)夜。
7. 次日更換培養基。

使用胰酶處理細胞

胰酶消化法是使用蛋白水解酶——胰蛋白酶將貼壁細胞從細胞培養容器表面解離下來(lái)的技術(shù)。這一方法在需要獲取細胞時(shí)使用（例如傳代、計數或用于分離核酸）。

1. 吸去并丟棄培養基。
2. 使用PBS緩沖液（磷酸鹽緩沖鹽溶液）或HBSS溶液（Hanks平衡鹽溶液）洗滌細胞，再吸棄。重復該步驟。
   PBS或HBSS溶液的體積應該近似于培養細胞所使用的培養基體積。
3. 加入足夠的預熱1x胰蛋白酶–EDTA溶液，覆蓋整個(gè)單細胞層，并震蕩培養瓶/培養皿4–5次以充分結合。
4. 將培養瓶/培養皿放置于二氧化碳培養箱中，在37°C下孵育1–2分鐘。
5. 從培養箱中取出培養瓶/培養皿，以手掌用力敲擊培養瓶/皿的側面，幫助細胞解離下來(lái)。如果細胞仍未脫離，將培養瓶/皿重新放回培養箱繼續溫育幾分鐘。
   重要：從培養箱中取出培養瓶/培養皿，以手掌用力敲擊培養瓶/皿的側面，幫助細胞解離下來(lái)。如果細胞仍未脫離，將培養瓶/皿重新放回培養箱繼續溫育幾分鐘。不要將細胞置于1x胰蛋白酶–EDTA溶液中過(guò)長(cháng)時(shí)間。細胞被充分消化之前不要強迫細胞脫離培養容器，否則可能會(huì )發(fā)生聚團。
   過(guò)度生長(cháng)的培養物、老化細胞及某些細胞系可能難于被胰蛋白酶消化。盡管增加胰蛋白酶的處理時(shí)間能夠有助于解離剩余細胞，但某些細胞類(lèi)型對胰蛋白酶非常敏感，接觸時(shí)間延長(cháng)可能導致這些細胞死亡。另外，某些細胞系能夠抵抗這種消化而形成細胞團塊。
6. 細胞一旦解離，使用含血清的生長(cháng)培養基對細胞進(jìn)行重懸。請使用含同等比例血清的培養基進(jìn)行細胞培養。血清能夠消除胰蛋白酶的活性。
7. 使用注射器針頭輕柔地前后吹散細胞團塊。 
   如果吹動(dòng)過(guò)于劇烈，細胞將受到傷害。請確保吹動(dòng)過(guò)程中無(wú)氣泡產(chǎn)生。
8. 按照需要進(jìn)行后續操作（例如傳代、凍存、核酸分離等等）。

1x PBS

pH值應無(wú)需調整即為7.4。在室溫下保存。

組分
137 mM NaCl
2.7 mM KCl
4.3 mM Na2HPO4
1.47 mM KH2PO4

1x HBSS

pH值應無(wú)需調整即為7.4。在室溫下保存。

組分
5 mM KCl
0.3 mM KH2PO4
138 mM NaCl
4 mM NaHCO3
0.3 mM Na2HPO4
5.6 mM D-glucose

1x trypsin–EDTA溶液

*將1x trypsin-EDTA溶液儲存在–20°C下。小體積等分液可儲存在2–8°C達1–2周。培養細胞中使用胰蛋白酶時(shí)需盡快操作，因為胰蛋白酶在37°C 下會(huì )降解，酶活性迅速下降。

組分
0.05% (w/v) 胰蛋白酶
0.53 mM EDTA
在鈣和鎂的鹽溶液，如1x PBS或1x HBSS中溶解胰蛋白酶和EDTA。*

細胞傳代

許多貼壁細胞培養物一旦相互接觸即停止增殖（例如當它們完全覆蓋細胞培養容器的表面），某些類(lèi)型的細胞在接觸過(guò)長(cháng)時(shí)間之后將會(huì )死去。因此貼壁細胞培養物一旦相互匯集，就需要進(jìn)行常規的傳代操作；在此過(guò)程中一部分細胞被種植于一個(gè)新的細胞培養容器內。懸浮細胞將飛快耗盡他們的培養基，一旦細胞密度變得過(guò)高，這些培養物也即需要進(jìn)行常規的傳代操作。

重要：盡管常規的傳代對于維系動(dòng)物細胞培養物十分必要，但這一操作對于貼壁細胞還是具有相對壓力的，因為在此過(guò)程中這些細胞會(huì )受到胰酶的消化。我們不建議在短于48小時(shí)的時(shí)間間隔內頻繁進(jìn)行傳代操作。

1. 通過(guò)胰酶消化（貼壁細胞培養物）或在200 xg離心5分鐘（懸浮細胞培養物）采集細胞。使用適當體積的已預熱生長(cháng)培養基（含血清）重懸細胞。 
   重懸過(guò)程所使用的培養基體積是基于所需的稀釋比（參見(jiàn)第二步）和細胞培養容器的體積來(lái)確定的。如果使用體積過(guò)小，則難于精確吸取所需要的體積加入新培養容器。
   相反地，如果使用體積過(guò)大，新培養容器可能會(huì )被加入的細胞溶液所填滿(mǎn)。
   在某些情況下，采集貼壁細胞之后對胰蛋白酶進(jìn)行去除是必要的，特別是對于原代細胞和敏感的細胞類(lèi)型而言。在200 xg下離心細胞5分鐘，小心地吸去上清，并使用適當體積的預熱培養基（含血清）對細胞沉淀進(jìn)行重懸。
2. 將適當體積的重懸細胞液轉移至含有已預熱生長(cháng)培養基的新細胞培養容器中。輕柔渦動(dòng)容器使細胞和培養基充分混勻。
   重要：徹底混勻細胞，從而確保細胞在細胞培養容器中分布均勻。
   重要：某些細胞類(lèi)型如果傳代量過(guò)少，將不會(huì )存活。我們不建議對原代細胞、敏感細胞類(lèi)型或衰老細胞使用高稀釋比。
   對于貼壁細胞，我們建議在傳代中加入足夠數目的細胞，以培養物在一周左右時(shí)間重新長(cháng)滿(mǎn)為宜。這不僅讓胰酶消化的時(shí)間最小化，也使培養的操作時(shí)間變得最短。
   在確定向新細胞培養容器中轉移細胞的數量時(shí)，以細胞需要多少次分裂能夠重新形成匯聚的角度進(jìn)行思考，可能會(huì )有所幫助。例如如果傳代一半細胞，那么只需分裂一次即可長(cháng)滿(mǎn)。如果轉移四分之一的細胞數目，那么需要兩次分裂，如此進(jìn)行思考。如果培養物每30小時(shí)分裂一次，那么一周時(shí)間內可能需要約5次分裂才能夠長(cháng)滿(mǎn)。因此1:32（1:25）的稀釋比例對于在約一周時(shí)間內完成細胞匯合是比較合適的。在第一步當中，如果使用8 ml培養基重懸細胞，則應向新的細胞培養容器中轉移0.25 ml細胞懸液。
3. 將細胞在其常用的生長(cháng)條件下進(jìn)行孵育。

細胞計數

使用血細胞計數器對細胞進(jìn)行計數

有許多情況需要對細胞進(jìn)行計數，例如為轉染實(shí)驗進(jìn)行細胞種植培養時(shí)?？梢允褂醚毎嫈灯鲗毎嫈?。一個(gè)血細胞計數器含有兩個(gè)小室。每個(gè)小室被劃分為9個(gè)主要的正方形區域（每個(gè)體積為0.1 mm³或1x10^–4 ml）。通過(guò)對已知深度（體積）的特定區域內的細胞進(jìn)行計數，來(lái)確定細胞濃度。

這一方法也收錄于參考資料1、2和4當中。請注意也可使用許多其他的方法。

1. 使用70%乙醇或其他適當的消毒劑清潔血細胞計數器表面，當心不要刮傷計數器中央區的表面。使用拭鏡紙擦干計數器。
2. 清潔蓋玻片并輕輕潤濕其邊緣，將其放置于血細胞計數器的凹槽和中央區上方后，輕輕壓下。
   將蓋玻片正確貼附于計數器之上以獲得準確的小室深度，是十分重要的。通過(guò)觀(guān)察牛頓環(huán)的出現（蓋玻片與血細胞計數器玻璃表面之間的空氣干涉所形成的明暗環(huán)）能夠對蓋玻片的正確放置進(jìn)行確證。
3. 通過(guò)胰酶消化（貼壁細胞培養物，參見(jiàn)使用胰酶處理細胞）或在200 xg下離心5分鐘（懸浮細胞培養物）采集細胞。使用適當體積的已預熱生長(cháng)培養基對細胞進(jìn)行重懸。精確計數需要至少10⁶個(gè)/毫升的細胞濃度。
   小貼士：可能需要離心細胞并以較小體積進(jìn)行重懸，已獲得計數所需的細胞濃度。對于貼壁細胞，在胰酶處理之后制成單細胞懸液十分重要。細胞團塊將會(huì )對計數造成困難和錯誤。
4. 將細胞懸液樣本徹底混勻。使用槍頭從蓋玻片的一側加入20 μl細胞懸液，以充滿(mǎn)計數器的一個(gè)小室。重復該操作充滿(mǎn)另一個(gè)計數小室。 
   兩個(gè)計數小室中的細胞分布應均勻一致。細胞懸液是通過(guò)毛細作用進(jìn)入蓋玻片和小室之間的。
   細胞懸液剛好充滿(mǎn)計數小室即可。吸去任何多余液體不會(huì )對蓋玻片下的細胞樣品產(chǎn)生干擾。
5. 將計數器置于顯微鏡下，使用10x物鏡和10x目鏡觀(guān)察以3條線(xiàn)劃出的大正方形區域。 
   對9個(gè)主正方形中的5個(gè)統計細胞總數。僅統計正方形上邊線(xiàn)和左邊線(xiàn)上的細胞，忽略與正方形下邊線(xiàn)和右邊線(xiàn)重疊的細胞。這能夠避免將細胞重復計數兩次。如果細胞密度過(guò)高，則需要對細胞懸液進(jìn)行稀釋?zhuān)堊⒁膺x擇合適的稀釋比例。
6. 再對第二腔室進(jìn)行統計，合計10個(gè)正方形區域。
7. 將10個(gè)正方形區域的細胞總數相加，得到10^–3 ml體積中的細胞數量。將得數乘以1000，獲得每毫升的細胞個(gè)數。
   重要: 如果將原始細胞懸液稀釋用于計數，還要乘以稀釋比例以獲得實(shí)際的每毫升細胞數。
8. 使用70%乙醇和蒸餾水依次清潔血細胞計數器和蓋玻片，并使用拭鏡紙擦干。

凍存細胞和對細胞活力的染色鑒定

對于某些細胞培養物，特別是貴重的種類(lèi)，通常的做法是建立雙份冷凍細胞庫：一個(gè)主細胞庫和一個(gè)工作細胞庫。工作細胞庫包含了主細胞庫中的細胞樣本，它們在儲存之前已經(jīng)培養生長(cháng)了數代。需要調用該細胞樣本時(shí)，就從工作細胞庫中取用。主細胞庫只有絕對必要時(shí)才會(huì )使用。這能夠確保所保存原始細胞的分裂數達到最低，并避免其在培養物中發(fā)生遺傳變異。

1. 查驗細胞是否健康、未污染、且形態(tài)正常。
2. 在細胞凍存前24小時(shí)進(jìn)行換液。
   貼壁和懸浮細胞培養物不宜以高濃度凍存。我們建議在細胞的對數生長(cháng)期實(shí)施凍存。
3. 貼壁培養物：通過(guò)胰酶消化采集細胞，將其重懸與包含血清的培養基中，在200 xg離心5分鐘，之后使用冷凍培養基以3–5x10⁶個(gè)/毫升的濃度重懸細胞。
   懸浮培養物：將細胞在200 xg下離心5分鐘，以5–10x10⁶個(gè)/毫升的細胞濃度重懸于凍存培養基中。
   重要：含有DMSO（二甲亞砜）的凍存培養基有毒性，需小心操作。
4. 將1 ml細胞懸液（貼壁細胞約為3–5x10⁶，懸浮細胞為5–10x10⁶）轉移至單個(gè)凍存管中。在凍存管上注明細胞系名稱(chēng)、日期、傳代數和生長(cháng)培養基種類(lèi)。
   小貼士：凍存之前在凍存管上注明細胞密度也會(huì )對后續實(shí)驗有所助益。這些標記將幫助在解凍后挑選最佳的復蘇密度。
5. 將凍存管放在支架上，再安置于聚苯乙烯盒中（盒壁約厚15毫米），并襯以棉絨。將存儲盒放于–80°C冰箱過(guò)夜。
   將細胞以1°C/分鐘的速率進(jìn)行冰凍是十分重要的?？墒褂镁哂斜鶅鏊俾士刂颇芰Φ脑O備代替聚苯乙烯盒+棉絨的方法。
6. 次日快速將凍存管轉移至液氮罐中，確保凍存管未發(fā)生解凍。

凍存培養基

大部分懸浮細胞被冷凍在含有DMSO的凍存培養基中。
在–20°C下儲存

組分
生長(cháng)培養基（RPMI、 DMEM等）含有10–20% FBS的 5–20%甘油或DMSO

活菌染色

臺盼藍染色法能夠區分培養物中的存活（可增殖）和無(wú)活力細胞。這一染色法基于染料排斥原理，具有完整細胞膜的細胞能夠排斥（即不被染色）染料，因此可看作是活細胞。

1. 通過(guò)胰酶消化（貼壁細胞培養物）或在200 xg離心5分鐘（懸浮細胞培養物）采集細胞。使用適當體積的已預熱生長(cháng)培養基對細胞沉淀進(jìn)行重懸，重懸的細胞密度為至少10⁶個(gè)/毫升。
2. 在0.1 ml細胞懸液中加入0.5 ml 0.4%（質(zhì)量體積比）臺盼藍染料和0.3 ml PBS或Hank's平衡鹽溶液（HBSS；參見(jiàn)表 1xPBS和 1xHBSS）。充分混勻，再靜置1–2分鐘。也可在0.4 ml生長(cháng)培養基的細胞體系中直接加入0.4 ml臺盼藍染料。
   精確計數需要至少10⁶個(gè)/毫升的細胞密度。
3. 使用血細胞計數器對著(zhù)色和非著(zhù)色細胞進(jìn)行計數。染為藍色的細胞活力較差，非著(zhù)色細胞的活力良好?；盍毎麛的?總細胞數目=活力比率（%）

臺盼藍

在室溫保存。

組分	量
臺盼藍	0.4 g
1x PBS或1x HBSS	100 ml

參考文獻

1. Freshney, R.I. (1993) Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique, 3rd ed., New York: Wiley-Liss.
2. Spector, D., Goldman, R.R., and Leinwand, L.A., eds. (1998) Cells: a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
3. Drexler, H.G. et al., eds. (1997) DSMZ Catalog of Human and Animal Cell Lines. 6th ed.
4. Ausubel, F.M. et al. eds. (1991) Current protocols in molecular biology. New York: Wiley Interscience.