蛋白質(zhì)一詞來(lái)自希臘語(yǔ)proteios，意思是“頭等重要的”。這個(gè)術(shù)語(yǔ)有瑞典科學(xué)家J?ns Berzelius在1838年創(chuàng )造，反映這類(lèi)分子的重要性。
一段DNA分子稱(chēng)作基因，其攜帶有構建蛋白質(zhì)所需的信息。據信在人類(lèi)基因組(1)中包含有20000到25000個(gè)基因，但是在人類(lèi)蛋白質(zhì)組(2)中卻包含有超過(guò)1百萬(wàn)種蛋白質(zhì)，使得蛋白質(zhì)成為所有生物學(xué)分子中種類(lèi)最豐富的分子?；蚝偷鞍踪|(zhì)的數量之間的差異是由于這樣的事實(shí)：一個(gè)基因能夠產(chǎn)生多種蛋白質(zhì)，并且產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可以進(jìn)行化學(xué)修飾（通常由其他蛋白質(zhì)）來(lái)改變它們的特性和活性。
蛋白質(zhì)由氨基酸構建而成。天然存在的氨基酸有二十種，由此構成了所有天然存在的蛋白質(zhì)。所有二十種氨基酸基于一種通用的結構，差別體現在各自所謂的側鏈化學(xué)特性方面。一些（例如，色氨酸和苯丙氨酸）是強疏水氨基酸，而其他的（例如，賴(lài)氨酸和天冬氨酸）則在生理PH值下攜帶離子電荷，這使得表現得親水。氨基酸通過(guò)肽鍵鏈接在一起形成蛋白質(zhì)鏈。蛋白質(zhì)中氨基酸的排列順序和蛋白質(zhì)鏈折疊的樣式?jīng)Q定了其特性。
分子生物學(xué)在過(guò)去數十年中的進(jìn)步極大促進(jìn)了蛋白質(zhì)研究的進(jìn)展。以前，獲得特定蛋白質(zhì)的唯一方法就是從天然來(lái)源中純化，這個(gè)過(guò)程往往非常低效、耗時(shí)。隨著(zhù)分子重組生物技術(shù)的出現，我們能夠克隆一個(gè)編碼目標蛋白質(zhì)的DNA并且在表達載體細菌（通常是大腸桿菌中表達出該蛋白質(zhì)。翻譯一段DNA序列即可構建為一種蛋白質(zhì)，這種遺傳密碼的通用性使得任何生物體的蛋白質(zhì)都可以快速而大量表達。
本部分描述了蛋白質(zhì)表達、分析、檢測和實(shí)驗的程序方法。
重組蛋白質(zhì)表達一般包括：通過(guò)構建一個(gè)編碼目標蛋白的質(zhì)粒，轉移質(zhì)粒到所需要的宿主細胞，培養宿主細胞并且誘導蛋白表達，然后裂解細胞，純化蛋白質(zhì)，操作SDS–PAGE分析來(lái)驗證獲得的蛋白質(zhì)。
本在線(xiàn)指南的DNA部分中給出的用于處理和轉化E. coli的實(shí)驗方案和重組方法同樣適用于重組蛋白的生產(chǎn)。通過(guò)仔細選擇宿主細胞株系、載體和生長(cháng)條件，大部分重組蛋白都能在E. coli中高水平的克隆和表達。在嘗試大規模蛋白純化之前需要建立小規模培養，以便優(yōu)化目標蛋白生長(cháng)和表達條件。
培養基
包含表達質(zhì)粒的E. coli生長(cháng)所選用的培養基是LB培養基及其改良培養基2x YT或者Super Broth，這幾種培養基都含有相關(guān)的篩選抗生素。開(kāi)始時(shí)，建議嘗試在所有三個(gè)培養基中平行表達，并在誘導后進(jìn)行時(shí)程分析以監控生長(cháng)和表達。我們時(shí)常能觀(guān)察到，在不同時(shí)間、不同培養基中，會(huì )出現表達水平顯著(zhù)差異。
表達質(zhì)粒的維持
細胞中質(zhì)粒維持較差會(huì )導致表達水平較低。氨芐青霉素是一種不穩定的抗生素，在生長(cháng)培養基中會(huì )迅速耗盡，其中部分是由耐藥細菌細胞分泌的β–內酰胺酶消耗掉的。
將細胞從表達培養基平板接種到添加/不添加氨芐青霉素的平板上以檢查質(zhì)粒水平是很重要的。如果表達結構的穩定性存在問(wèn)題，則培養物應該在濃度為200 μg/ml氨芐青霉素的培養基上生長(cháng)，并且在長(cháng)期培養的過(guò)程中要不斷補充氨芐青霉素以維持其濃度水平。另外，培養物也可能在羧芐青霉素存在的情況下生長(cháng)，這是一種更穩定的β–內酰胺，濃度是50 μg/ml。
培養物小規模表達
強烈建議進(jìn)行小規模表達和純化實(shí)驗，并且應該在大規模制備之前進(jìn)行。在許多情況下，可以在少量樣品緩沖液中裂解若干等份的細胞并且直接使用SDS–PAGE進(jìn)行分析。少量培養物表達的作用是提供一種判斷不同生長(cháng)條件對表達水平以及重組蛋白溶解性的影響快速方法。新轉化細胞不同菌落的表達水平各異，而小規模制備可以挑選出最優(yōu)表達率的菌落。
誘導蛋白表達
誘導蛋白表達所使用的方法依賴(lài)于質(zhì)粒載體和大腸桿菌所用菌株。升高培養溫度，或者向培養基中添加化學(xué)誘導物（例如異丙基–B–D–硫代半乳糖苷(IPTG)），可以誘導蛋白表達。誘導方法的細節以及相關(guān)的質(zhì)粒請見(jiàn)標準分子生物學(xué)(3,4)部分。
蛋白表達的時(shí)程分析
為了優(yōu)化給定蛋白結構的表達，建議使用一種利用SDS–PAGE技術(shù)的蛋白表達水平的時(shí)程分析方法。細胞內蛋白質(zhì)含量通常是可溶性蛋白質(zhì)、形成的細胞包涵體和蛋白質(zhì)降解之間的平衡。通過(guò)檢查誘導后不同時(shí)間蛋白質(zhì)的存在，可以建立最佳誘導期。
菌落印跡
我們建議采用菌落印跡法鑒別表達某一種蛋白的菌落和半定量區分不同的表達率。這可能是轉化后篩選菌落的較優(yōu)方法，因為新轉化的菌落在表達率方面會(huì )顯著(zhù)差異。使用該方法，可以輕松地區分蛋白表達率低至0.1–0.5 mg/L的菌落與不表達蛋白的菌落。
不建議將化學(xué)發(fā)光法與菌落印跡法共同使用。
實(shí)驗材料
制備緩沖液、試劑和瓊脂平板。參見(jiàn)表10% SDS、變性溶液、中和溶液和 20x SSC。以及瓊脂平板。
| 工作溶液 | 成分 | 每升的量 |
|---|---|---|
| 10% (w/v) SDS | SDS | 100 g |
| 工作溶液 | 成分 | 每升的量 |
|---|---|---|
| 0.5 M NaOH | NaOH | 20 g |
| 1.5 M NaCl | NaCl | 87.7 g |
| 工作溶液 | 成分 | 每升的量 |
|---|---|---|
| 1.5 M NaCl | NaCl | 87.7 g |
| 0.5 M Tris base | Tris base | 60.6 g |
| 工作溶液 | 成分 | 每升的量 |
|---|---|---|
| 3 M NaCl | NaCl | 175.3 g |
| 0.3 M sodium citrate | Sodium citrate·2H2O | 88.2 g |
瓊脂平板
制備：依據表“LB培養基”中給出的成分配制LB培養基。每升添加15 g瓊脂糖并混勻，接著(zhù)高壓滅菌。高壓滅菌后，輕輕渦旋培養基以便熔融的瓊脂均勻的分布于溶液中。請注意在渦旋過(guò)程中不要造成熱液沸溢。
| 成分 | 每升的量 |
|---|---|
| Tryptone | 10 g |
| Yeast extract | 5 g |
| NaCl | 10 g |
小貼士：在添加熱敏抗生素和營(yíng)養成分前，冷卻高壓滅菌瓊脂培養基到50°C以下（手握時(shí)感到溫度適宜）。在傾倒平板前，請徹底混勻以便得到均一濃度的培養基。
小貼士：在潔凈層流罩內傾倒平板，如果沒(méi)有層流罩，則在靠近本生燈干凈實(shí)驗臺上進(jìn)行。每個(gè)標準90 mm培養皿使用30–35 ml培養基（每升培養基約30個(gè)平板）。
傾倒平板后，如果產(chǎn)生氣泡，可以用本生燈的火焰快速掠過(guò)培養基表面來(lái)清除?；鹧娌坏?，切勿讓火焰在某處來(lái)回燒灼，否則可能造成平板切片內的抗生素遭破壞。
在凝固之后或者臨使用之前，取下帽蓋并將平板立在層流罩內1小時(shí)，直接干燥平板。此外，如果您手上沒(méi)有層流罩，則可輕微開(kāi)啟平板蓋，于37°C下在培養箱中干燥平板30分鐘，或蓋上蓋子在室溫下倒置放置2–3天。
小貼士：為保持對光線(xiàn)明暗的抗生素的活性，可將平板倒置，在4°C黑暗條件下儲存，或者將平板卷在鋁箔紙中。存儲時(shí)間請勿超過(guò)3個(gè)月，因為這會(huì )造成抗生素降解。
操作步驟
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在含有適當抗生素的LB瓊脂平板上接種新轉化細胞，孵育過(guò)夜。
小貼士：鋪展轉化混合物涂布后，平板上蓋微開(kāi)啟倒置干燥，直到瓊脂表面出現褶皺。為了防止涂污，直到所有的液體已被瓊脂吸收后，才能開(kāi)始孵育。
小貼士：為避免在誘導物缺乏的情況下表達有毒的蛋白質(zhì)（啟動(dòng)子“滲漏”的結果），并保持質(zhì)粒的穩定性，請于30℃下孵育。
小貼士：如果所表達的蛋白質(zhì)沒(méi)有毒性并且質(zhì)粒穩定，可以在37℃下孵育，但應注意，該菌落不得變的太大。 - 從培養箱中取出平板，略微打開(kāi)上蓋，干燥10分鐘去除冷凝水。
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將干燥的、已編號的硝酸纖維素濾膜放置在瓊脂表面并與菌落接觸，注意不要引入氣泡。
小貼士：用鈍頭鑷子夾住濾紙的對邊，并輕輕地降低放在瓊脂表面，使得濾紙中間首先接觸，然后再降低（但不要掉落）濾紙的邊沿。
小貼士：用防水標記筆或鉛筆對濾紙標號。 - 使用注射器針頭，在不對稱(chēng)的位置刺破濾紙和瓊脂，以方便后續檢測是否正確對準。用鈍頭鑷子夾緊濾紙邊沿，并將它一次性剝離。
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轉移濾紙（菌落的一面朝上）至新鮮的LB瓊脂平板上并誘導表達，例如，通過(guò)使用含有抗生素和2250 μM IPTG的平板（參見(jiàn)“誘導蛋白表達”）。在此過(guò)程中請避免引入氣泡。
小貼士：用鈍頭鑷子夾住濾紙的對邊，并輕輕地降低放在瓊脂表面，使得濾紙中間首先接觸，然后再降低（但不要掉落）濾紙邊沿。 - 在37℃下孵育平板4小時(shí)，將主板在30℃培養箱中孵育4小時(shí)，使菌落再生。
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準備一套聚苯乙烯培養皿用于菌落溶解和蛋白質(zhì)結合到濾紙上。每個(gè)盤(pán)中應該有使用以下溶液浸泡過(guò)的Whatman 3MM paper。
培養皿1. 10% SDS 溶液
培養皿2. 變性溶液
培養皿3. 中和液
培養皿4. 中和液
培養皿5. 2x SSC
注意：丟棄多余的液體，使紙張濕潤但不濕透。過(guò)量的液體會(huì )促進(jìn)菌落膨脹和擴散，導致信號模糊。 -
將硝酸纖維素濾膜（菌落的一面朝上）放置在每個(gè)培養皿的頂部，同時(shí)注意排除氣泡（位于氣泡之上的菌落不會(huì )正確裂解，并將在最終的染色步驟中產(chǎn)生更大的本底顏色）。在室溫下依順序培養（在步驟7中制備的）聚苯乙培養皿，如下所示：
培養皿1. 10% SDS 溶液10分鐘
培養皿2. 變性溶液5分鐘
培養皿3. 中和液5分鐘
培養皿4. 中和液5分鐘
培養皿5. 2x SSC 15分鐘 -
使用顯色底物的免疫檢測繼續進(jìn)行該實(shí)驗方案。
小貼士：由于存在高本底色的問(wèn)題，不推薦使用化學(xué)發(fā)光底物實(shí)驗方案進(jìn)行菌落吸印轉移后的檢測。
注：有時(shí)表達蛋白質(zhì)的菌落與不表達的菌落之間只有輕微的差別。
小貼士：這一過(guò)程要求較短的染色時(shí)間，2–3分鐘的染色通常是足夠的，但是在這個(gè)階段監測顯色的變化是非常重要的。
小貼士：如果仍然難以區分陽(yáng)性菌落和本底顏色，應該考慮產(chǎn)生高本底色的原因。
應該包括下面的對照：
- 無(wú)表達質(zhì)粒的宿主細菌平板
- 含有無(wú)嵌入片段的表達質(zhì)粒的宿主細菌平板
- 在檢測前只用二抗處理過(guò)的菌落印跡
- 表達目標蛋白的陽(yáng)性對照，如果可能的話(huà)
培養標準表達培養物（100ml）
- 接種含有相關(guān)抗生素的10 ml培養基到50 ml燒瓶中。37°C培養物生長(cháng)過(guò)夜。
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用5 ml過(guò)夜培養物接種100 ml預熱的培養基（含抗生素），在37°C下生長(cháng)并劇烈振蕩，直到OD 600達到0.6（30–60分鐘）。
小貼士：臨誘導前取1ml樣品。該樣品是非誘導對照。沉淀細胞，在50 μl 5x SDS-PAGE樣品緩沖液中重懸。在SDS-PAGE分析前，保存于–20°C下保存。 - 誘導表達（例如，添加IPTG至終濃度1 mM）。
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額外孵育培養物4–5小時(shí)。
小貼士：收集第二個(gè)1 ml樣品。該樣品是誘導對照。沉淀細胞，在100 μl 5x SDS–PAGE樣品緩沖液中重懸。SDS-PAGE分析前，于–20°C下凍存樣品。
小貼士：如果第一次表達一種蛋白質(zhì)，每隔一小時(shí)取1 ml樣品并按上述步驟處理以獲得表達的時(shí)程。 - 4000 x g離心20分鐘收獲細胞
- 在干冰–乙醇或者液氮中冷凍細胞，或者在–20°C下保存細胞沉淀過(guò)夜。
產(chǎn)品制備（1L）培養物培養
- 接種含有相關(guān)抗生素20 ml的培養基。在37°C劇烈振蕩生長(cháng)過(guò)夜。
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按照1：50比例接種1L培養物與非誘導過(guò)夜培養物。在37°C劇烈振蕩生長(cháng)直到OD600達到0.6。
小貼士：臨誘導前立刻取1 ml樣品。該樣品是非誘導對照。沉淀細胞，在50 μl 5x SDS-PAGE樣品緩沖液中重懸。在SDS-PAGE分析前，于–20°C下保存。 - 誘導表達（例如，添加IPTG至終濃度1 mM）。
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額外孵化培養物4–5小時(shí)。
小貼士：收集第二個(gè)1 ml樣品。該樣品是誘導對照。在微量離心管中沉淀細胞并于100 μl 5x SDS–PAGE樣品緩沖液中重懸。在SDS-PAGE分析前，于–20°C下保存。 - 4000x x g離心20分鐘收獲細胞。在干冰–乙醇或者液氮中冷凍細胞，或者在–20°C下保存細胞沉淀過(guò)夜。
重組蛋白的表達和純化有利于生產(chǎn)和分析幾乎任何蛋白質(zhì)。雖然目前已開(kāi)發(fā)了各種各樣的異源表達系統并已用于重組蛋白生產(chǎn)，但是蛋白質(zhì)純化仍可能存在有問(wèn)題。理論上說(shuō)，我們可以繼續采用經(jīng)典的純化方法，但在大多數情況下，重組DNA技術(shù)允許構建融合蛋白，其中特異性的親和標簽被添加到目標蛋白質(zhì)序列中；這些親和標簽的作用是通過(guò)親和層析的方法簡(jiǎn)化重組融合蛋白的純化過(guò)程。理想的情況下，一個(gè)標記應該是微小的，并且對重組蛋白的結構、活性和性質(zhì)的影響最小。不同的親和標簽有不同的大小和特性。相比26 kDa的谷胱甘肽S–轉移酶標記，30 kDa的蛋白A和40 kDa的麥芽糖結合蛋白，該6xHis標記大小只是0.84 kDa。FLAG標記只包含8個(gè)氨基酸，卻是高度免疫原性的，這意味著(zhù)使用重組蛋白生產(chǎn)抗體之前必須移除FLAG標記。與此相反，His標記具有極低的免疫原性，很少干擾蛋白質(zhì)的結構和功能，使His標記蛋白適用于各種下游應用而無(wú)需標記裂解。
SDS-PAGE分析的原理
十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS–PAGE)通過(guò)區分蛋白質(zhì)的大小對其進(jìn)行分離。在變性和還原的條件下加熱蛋白質(zhì)樣品，使其發(fā)生去折疊化并由SDS去垢劑分子進(jìn)行包裹，從而獲得與多肽鏈長(cháng)度對應成比例的高度網(wǎng)絡(luò )化的負電荷分子。當載入凝膠基質(zhì)并放置于電場(chǎng)中時(shí)，帶負電的蛋白質(zhì)分子將向帶正電的陽(yáng)極移動(dòng)，并通過(guò)分子篩效應得到分離。再通過(guò)蛋白質(zhì)特異性的染色技術(shù)進(jìn)行顯像，之后將蛋白質(zhì)的移動(dòng)距離與已知分子量的對照蛋白進(jìn)行比較，進(jìn)而可估計出目的蛋白的大小。同時(shí)也可將分離所得的蛋白質(zhì)轉印于帶正電荷的膜上，并使用蛋白特異性的抗體進(jìn)行探測，這一程序被稱(chēng)為蛋白質(zhì)印跡。
丙烯酰胺的濃度
凝膠中所使用的丙烯酰胺濃度是依據所分析蛋白質(zhì)的分子大小進(jìn)行選擇的。低丙烯酰胺濃度一般用于分離高分子量的蛋白質(zhì)，而高濃度丙烯酰胺則用于低分子量的蛋白分離過(guò)程。通過(guò)使用包含濃縮膠和分離膠的非連續電泳系統可進(jìn)一步提升蛋白質(zhì)條帶的分辨率。
在SDS–PAGE實(shí)驗之前處理稀釋或含鹽的樣本
為了濃縮稀釋的樣品或去除樣品中高濃度的鹽分（可能干擾SDS-PAGE實(shí)驗），可于SDS-PAGE分析之前對蛋白質(zhì)進(jìn)行酸性沉淀處理。
蛋白質(zhì)TCA沉淀
- 將樣品稀釋至100 μl；再添加100 μl 10%的三氯乙酸（TCA）。
- 放置于冰上20分鐘；在微量離心機中離心15分鐘。
- 使用100 μl冰乙醇洗滌沉淀物，揮發(fā)乙醇并重懸于5xSDS-PAGE樣品緩沖液中。在95°C下煮沸7分鐘，之后立即向SDS-PAGE凝膠中上樣。
SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)
所需材料
- 凝膠設備和電泳儀器
- 30%丙烯酰胺/0.8%雙丙烯酰胺原液
- 2.5x分離膠緩沖液
- 5x濃縮膠緩沖液
- 四甲基乙二胺（N,N,N,'N'–四甲基乙二胺，TEMED)
- 10%過(guò)硫酸銨
- 丁醇
- 5x電泳緩沖液
- 5xSDS–PAGE樣品緩沖液
- 蛋白質(zhì)樣品
重要：丙烯酰胺是一種潛在的神經(jīng)毒素，并可通過(guò)皮膚吸收。請采取適當的安全保護措施，特別是在稱(chēng)重固體丙烯酰胺/雙丙烯酰胺時(shí)和對溶液和凝膠進(jìn)行操作時(shí)。
小貼士：在SDS-PAGE實(shí)驗中只使用優(yōu)質(zhì)的試劑和水。凝膠緩沖液及自制的丙烯酰胺/雙丙烯酰胺原液需要過(guò)濾、隔絕空氣，并儲存于4°C下。
| 工作溶液的組成 | 成分 | 每升的量 |
|---|---|---|
| 30% acrylamide | Acrylamide | 300 g |
| 0.8% bis-acrylamide (N, N’-methylene-bis-acrylamide) | Bis-acrylamide | 8 g |
| 工作溶液的組成 | 成分 | 每升的量 |
|---|---|---|
| 1.875 M Tris·Cl | Tris base | 227.1 g |
| 0.25% SDS, pH 8.9 | SDS | 2.5 g |
| 工作溶液的組成 | 成分 | 每升的量 |
|---|---|---|
| 0.3 M Tris·phosphate | Tris base | 36.3 g |
| 0.5% SDS, pH 6.7 | SDS | 5 g |
| 工作溶液的組成 | 成分 | 每升的量 |
|---|---|---|
| 0.5 M Tris base | Tris base | 60.6 g |
| 1.92 M glycine | Glycine | 144.1 g |
| 0.5% SDS | SDS | 5 g |
-
按照制造商的說(shuō)明書(shū)組裝凝膠板與墊片
小貼士：凝膠板在使用前需徹底進(jìn)行清洗和烘干。 - 標記分離膠倒入的水平位置——比梳子和樣品孔低幾毫米。
-
在燒杯或類(lèi)似容器中混合下列溶液（以12%濃度，8x8或8x10厘米大小，1毫米厚度的微型丙烯酰胺凝膠為例）。
2.2 ml 30%丙烯酰胺/0.8%雙丙烯酰胺原液
2.2 ml 2.5x分離膠緩沖液
1.1 ml蒸餾水
5 μl TEMED
丙烯酰胺/雙丙烯酰胺溶液和水的體積需要按照所需的丙烯酰胺百分比進(jìn)行調整（基于需要進(jìn)行分離的目的蛋白大小。
小貼士：凝膠設備的大小需要依據所需凝膠溶液的體積來(lái)確定。 -
倒入凝膠液之前，加入50 μl 10%過(guò)硫酸銨并充分混勻。在組裝好的凝膠板之間倒入凝膠液，一直到達第二步所標記的水平線(xiàn)。之后將丁醇覆蓋于凝膠上表面。
小貼士：當使用丁醇可能對設備造成損害時(shí)，可以用水代替丁醇——請參見(jiàn)生產(chǎn)商提供的說(shuō)明書(shū)。
小貼士：一旦加入過(guò)硫酸銨，即需在丙烯酰胺完成聚合反應之前盡快倒入凝膠液。
小貼士：需每次制備新鮮的過(guò)硫酸銨溶液 -
當聚合反應完成后（20分鐘左右），倒掉丁醇，凝膠表面用水漂洗并瀝干。
小貼士：玻板上殘存的水滴可用濾紙片吸去。 -
混合下列試劑以制作濃縮膠：
0.28 ml 30% 丙烯酰胺/0.8% 雙丙烯酰胺原液
0.33 ml 5x濃縮膠緩沖液
1 ml蒸餾水
2 μl TEMED -
在倒入之前，向凝膠混合物中添加15 μl 10%的過(guò)硫酸銨溶液并混合均勻。隨后在分離膠上方倒入濃縮膠。插入梳子，避免引入氣泡。
小貼士：一旦加入過(guò)硫酸銨，則需在丙烯酰胺完成聚合反應之前盡快倒入濃縮膠。
小貼士：使用一支記號筆，在拔去梳子之前對樣品孔的位置和/或數量進(jìn)行標記。這將為上樣提供便利。 - 當濃縮膠完成聚合反應之后（10分鐘左右），就可以將凝膠放置于電泳槽中了。向電泳槽之中添入電泳緩沖液，并拔去梳子。
-
在上樣之前，向4倍體積的蛋白樣品中加入1倍體積的SDS-PAGE樣品緩沖液（例如向8 μl樣品中添加2 μl樣品緩沖液，獲得10 μl最終樣品體積）。簡(jiǎn)單渦旋之后在95°C下加熱5分鐘。
小貼士：在95°C的加熱過(guò)程中，短暫開(kāi)啟樣品管管蓋或用針在樣品蓋上刺出小孔，以釋放樣品管內逐漸增大的壓力。加熱之后，對樣品進(jìn)行簡(jiǎn)單的離心和渦旋步驟。 -
上樣并運行凝膠電泳。請參考設備制造商所提供的建議來(lái)設定電泳條件。
小貼士：上樣之前，使用一支大小合適的注射器和針頭，以1x電泳緩沖液沖洗樣品孔。
小貼士：將1x SDS-PAGE樣品緩沖液填入未使用的樣品孔，以確保樣品的移動(dòng)軌跡不會(huì )發(fā)生擴散。
小貼士：確保電極正確地完成連接。蛋白將向正極（標為+，通常為紅色）移動(dòng)。
小貼士：讓電泳一直運行，直至溴酚藍染料抵達凝膠下緣，這樣一般可保證蛋白條帶的充分擴展。
蛋白條帶顯像是通過(guò)將凝膠與染色液的共同孵育來(lái)完成的。最為常見(jiàn)的兩種方法是考馬氏染色法和銀染法。銀染相比考馬氏染色更為敏感，在凝膠中能夠檢測到2–5 ng的蛋白條帶。目前有許多可供參考的實(shí)驗方案，不過(guò)為了增加實(shí)驗結果的可重復性，還是推薦使用市售的試劑盒。蛋白質(zhì)的銀染效果基于銀與蛋白質(zhì)上的巰基或羧基之間的反應，該法不足以進(jìn)行定量，因為某些蛋白質(zhì)的銀著(zhù)色不強。此外，蛋白質(zhì)完成銀染之后即被氧化，無(wú)法進(jìn)入測序等后續應用?？捡R氏染色盡管敏感度稍差，但可以定量，并且考染后的蛋白質(zhì)仍可進(jìn)入后續的應用。
考馬斯染色法
所需材料
- 考馬斯染色液
- 脫色液
- 包含已分離蛋白質(zhì)的SDS聚丙烯酰胺凝膠。
| 工作溶液的組成 | 成分 | 每100 ml的量 |
|---|---|---|
| 0.05% (w/v) Coomassie Brilliant Blue R-250 | Coomassie Brilliant Blue R-250 | 50 mg |
|
40% (v/v)乙醇 |
乙醇 溶解，然后加入： |
40 ml |
| 10% (v/v)冰醋酸 | 冰醋酸 | 10 ml |
| 50% (v/v)水 | 水 | 50 ml |
| 工作溶液的組成 | 成分 | 每100 ml的量 |
|---|---|---|
| 40% (v/v)乙醇 | 乙醇 | 40 ml |
| 10% (v/v) 冰醋酸 | 冰醋酸 | 10 ml |
| 50% (v/v)水 | 水 | 50 ml |
-
將凝膠在考馬斯染色液當中孵育30分鐘至2小時(shí)，并溫和地搖動(dòng)。
小貼士：考馬斯亮藍R染料與蛋白質(zhì)非特異性地結合。 -
在脫色液當中溫和地搖動(dòng)已著(zhù)色的凝膠，直至凝膠的背景變得透明（1–2小時(shí)）。
小貼士：在褪色溶液中放置一張折疊的紙巾能夠吸去多余的染料，這樣脫色液可以重復使用。
完成脫色之后，蛋白質(zhì)在透明的凝膠背景當中顯示為藍色的條帶。通常情況下，含50 ng（以上）的蛋白條帶可顯像。
在完成電泳之后，可通過(guò)下列緩沖液槽式轉印設備或半干的電轉印設備將聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)轉印至帶有正電荷的薄膜（例如Schleicher and Schuell BA 85型硝酸纖維素膜）上。
在半干的電學(xué)印跡法中，凝膠和膜被兩疊經(jīng)電轉液潤濕的濾紙夾緊在中間。膜放置于陽(yáng)極（帶正電荷）一側，凝膠則更接近陰極（帶負電荷）。施加電流時(shí)，SDS包裹的負電荷蛋白質(zhì)就被轉印至膜上。當使用槽式印跡方法時(shí)，轉印盒被浸沒(méi)于轉印槽中。槽式印跡法可以運轉相當長(cháng)的時(shí)間，因為其緩沖容量遠遠大于半干轉印系統。通常情況下槽式印跡法的轉印更為有效——特別是對于分子量較大的蛋白——所獲得的結果更好。轉印效率可以通過(guò)在膜上使用麗春紅S染色進(jìn)行確證。一旦蛋白被轉印至膜上，就可以使用抗原特異性的抗體或共價(jià)結合物對其進(jìn)行探測。
Western轉印
所需材料
- 轉印設備
- 濾紙（例如Whatman 3毫米濾紙）
- 帶正電荷的薄膜（例如Schleicher and Schuell BA 85硝酸纖維素膜）
- 包含已分離蛋白的SDS聚丙烯酰胺凝膠
- 電轉液（半干轉印法或槽式印跡法的配方）
| 工作溶液的組分 | 成分 | 每升的量 |
|---|---|---|
| 25 mM Tris base | Tris base | 3.0 g |
| 150 mM glycine | Glycine | 11.3 g |
| 10% (v/v) methanol | Methanol | 100 ml |
| 工作溶液的組分 | 成分 | 每升的量 |
|---|---|---|
| 25 mM Tris base | Tris base | 3.0 g |
| 150 mM glycine | Glycine | 11.3 g |
| 20% (v/v) methanol | Methanol | 200 ml |
-
切取8塊濾紙和一塊薄膜，其大小都等同于凝膠。
小貼士：為了避免污染，請始終佩戴手套操作濾紙、膜和凝膠。 - 將膜在半干轉印緩沖液或槽式轉印緩沖液中孵育10分鐘。
- 將濾紙在半干轉印緩沖液或槽式轉印緩沖液中浸泡。如需進(jìn)行半干轉，進(jìn)入第4步；如需進(jìn)行槽式轉印則進(jìn)入第5步。
- 半干式轉?。?/strong>注意避免產(chǎn)生氣泡，將4片濾紙放置于陰極（帶負電，通常為黑色），之后在上面按次序放置凝膠、膜和另外4片濾紙，最后是陽(yáng)極（帶正電，通常為紅色）。
-
槽式印跡：注意避免產(chǎn)生氣泡生，將4片濾紙放置于纖維墊片上，之后按次序放置凝膠、膜和另外4片濾紙，最后是第二塊纖維墊片。
小貼士：產(chǎn)生的氣泡會(huì )導致該位置蛋白無(wú)法轉印?？梢酝ㄟ^(guò)在夾心結構的每一層上輕柔推動(dòng)一根巴斯德吸管來(lái)去除它們。 -
完成轉印流程。關(guān)于您設備使用的特定電流、電壓和轉印時(shí)間，請查閱生產(chǎn)商所提供的說(shuō)明書(shū)。
小貼士：具體的轉印時(shí)間主要依據蛋白的大小、丙烯酰胺的濃度和凝膠的厚度來(lái)確定。轉印效率可通過(guò)染色進(jìn)行監控（見(jiàn)下）。所需場(chǎng)強是通過(guò)凝膠的表面面積和厚度來(lái)決定的：0.8 mA /cm2是一個(gè)比較有用的基準（1個(gè)小時(shí)轉印時(shí)間）。 - 完成轉印之后，在膜上標記凝膠的方向。
麗春紅S染色
- 將膜放置于麗春紅S染色液中緩慢搖動(dòng)2分鐘。
- 在蒸餾水中進(jìn)行脫色，直至看到條帶。
- 核實(shí)不同大小的蛋白均勻轉印至膜上的效果。通過(guò)增加電轉液中的甲醇含量，可使疏水蛋白的轉印效率更高。
- 使用適當的筆（即使用一支不含水溶性墨汁的筆）或鉛筆在膜上做標記，或按需切割薄膜。
| 工作溶液的組分 | 成分 | 100 ml的量 |
|---|---|---|
| 0.5% (w/v) Ponceau S | Ponceau S | 0.5 g |
| 1% (v/v)冰醋酸 | 冰醋酸 | 1 ml |
斑點(diǎn)印跡法是一項用于直接檢測原始裂解液或溶液中蛋白的簡(jiǎn)便方法，無(wú)需使用SDS–PAGE進(jìn)行蛋白分離。該方法特別適于作為簡(jiǎn)單的對照實(shí)驗，因為它避免了由于Western轉印過(guò)程所帶來(lái)的相關(guān)問(wèn)題。不過(guò)任何干擾結合的成分，或非特異性結合的成分，都將無(wú)法與蛋白質(zhì)分離，從而對信號強度造成影響?？偸切枰褂眠m當的對照，來(lái)對此不足加以補償。
所需材料
- 硝酸纖維素膜（例如Schleicher and Schuell BA85型)蛋白質(zhì)樣品
- 蛋白樣本
- 天然或變性條件下的稀釋緩沖液
| 工作溶液的組分，pH 8.0 | 成分 | 每升的量 |
|---|---|---|
| 8 M urea | Urea | 480.5 g |
| 100 mM NaH2PO4 | NaH2PO4·H2O | 13.8 g |
| 10 mM Tris·Cl | Tris base | 1.2 g |
| 工作溶液的組分，pH 8.0 | 成分 | 每升的量 |
|---|---|---|
| 50 mM NaH2PO4 | NaH2PO4·H2O | 17.5 g |
| 300 mM NaCl | NaCl | 6.9 g |
-
使用緩沖液稀釋蛋白樣品，使蛋白終濃度達到1–100 ng/μl。
小貼士：使用變性條件的稀釋緩沖液、天然條件的稀釋緩沖液或另外優(yōu)選的緩沖液對目的蛋白進(jìn)行稀釋。 -
直接向膜上滴加1 μl稀釋的蛋白樣品。也可直接使用原始的細胞裂解液，滴加1 μl濃度估值為1–100 ng/μl蛋白的樣品。
注：特別是在天然條件下，該抗體對應的抗原決定簇必須至少形成部分的裸露，以完成抗體結合反應。在大多數情況下，使用含有變性劑的緩沖液稀釋蛋白會(huì )增加抗原決定簇的暴露機會(huì )，從而改善結果。
小貼士：為了對非特異性信號與陽(yáng)性信號進(jìn)行有效區分，可于膜上額外滴加1 μl不含質(zhì)粒的宿主菌細胞抽提物樣本（或其他適當的對照），與目的蛋白共同進(jìn)行處理和觀(guān)察。 -
點(diǎn)樣之后，在室溫下短暫晾干薄膜，之后再進(jìn)入檢測環(huán)節。
小貼士：如需檢測較大的樣本體積，可選擇某些供應商所提供的適當儀器。 - 進(jìn)行免疫檢測。
蛋白質(zhì)檢測：在膜上由特異性抗體所介導的蛋白質(zhì)檢測
抗體的運用
抗體是動(dòng)物在對外界異物（抗原）的響應中所專(zhuān)一合成的蛋白。通過(guò)向動(dòng)物體內注射抗原，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間之后在動(dòng)物的血清中即可采集針對注入蛋白的特異性抗體，即所謂的IgG（免疫球蛋白G）。每一抗體都對抗原上的某一特定區域具有專(zhuān)一親和力?？乖系倪@一區域被稱(chēng)為抗原決定簇?？贵w——抗原決定簇之間的相互作用被人們用來(lái)對膜上固著(zhù)的蛋白樣本進(jìn)行特異而又敏感的檢測，稱(chēng)為免疫檢測。與靶標蛋白特異性結合的抗體稱(chēng)為第一抗體，它們通常是從兔或小鼠中獲得的。在膜表面孵育一抗，使其與靶蛋白相互結合。之后為了對一抗進(jìn)行定位（也就定位了靶蛋白的位置），還需要二抗體。二抗能夠針對性地識別和結合另一動(dòng)物來(lái)源的所有免疫球蛋白G抗體。因此實(shí)驗中所使用的二抗需要直接識別和結合一抗來(lái)源動(dòng)物的IgG。例如，如果一抗是源自小鼠，那么可以使用山羊抗小鼠的二抗進(jìn)行檢測。二抗通常與化學(xué)報告基團相偶聯(lián)，從而方便對抗體檢測和顯影。通常該報告基團是一些熒光素分子，或能夠生色或介導發(fā)光反應的酶。一抗如果直接化學(xué)偶聯(lián)報告酶，則稱(chēng)之為偶聯(lián)物，可用于直接檢測而無(wú)需二抗參與。
檢測膜上的蛋白
當蛋白樣本從SDS–PAGE凝膠中轉印至膜上之后，還需對膜上剩余的無(wú)蛋白位點(diǎn)進(jìn)行封閉。通過(guò)這一步驟能夠避免一抗或二抗與膜直接結合，造成很高的本底信號。通常使用的一些封閉劑包括脫脂奶粉、牛血清清蛋白(BSA)和酪蛋白。封閉處理完成后，加入一抗與蛋白進(jìn)行結合。洗脫之后（去除非特異性結合的抗體），再加入二抗對之前的一抗進(jìn)行檢測。再次洗脫之后，二抗的結合位點(diǎn)（也就是一抗和靶蛋白的位置）通過(guò)加入二抗偶聯(lián)酶的底物進(jìn)行探測。酶的底物被催化能夠在反應位點(diǎn)生成有色化合物（顯色反應），或發(fā)光（化學(xué)發(fā)光檢測）。通常情況下將專(zhuān)一性識別某一特定抗原決定簇的抗體應用于對重組蛋白的檢測，能夠免去對蛋白特異性抗體的依賴(lài)，這樣僅使用一種抗體就可以檢測幾乎所有包含該抗原決定簇的重組蛋白。將報告酶與該類(lèi)抗體直接偶聯(lián)可進(jìn)一步免除對二抗的需求，從而在很大程度上節省實(shí)驗的時(shí)間成本。關(guān)于免疫檢測實(shí)驗流程的詳細信息，請參閱最新的《Molecular Biology》手冊（3,4）。
使用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行免疫檢測
所需材料
- 蛋白質(zhì)印跡
- TBS緩沖液
- TBS–Tween/Triton緩沖液
- 封閉緩沖液
- 一抗（蛋白特異性）原液
- 二抗—酶偶聯(lián)物原液
- 二抗稀釋緩沖液
- 化學(xué)發(fā)光底物
注：當進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測時(shí)，BSA通常不足以完全封閉二抗對膜的非特異性結合效果，所以通常使用奶粉來(lái)稀釋二抗。不過(guò)在某些案例中，使用奶粉緩沖體系進(jìn)行二抗稀釋也可能造成檢測敏感性的降低。如果遇到此類(lèi)情況，應使用BSA溶液稀釋一抗，使用牛奶稀釋二抗。
| 工作溶液的組分，pH 7.5 | 成分 | 每升的量 |
|---|---|---|
| 10 mM Tris·Cl | Tris base | 1.2 g |
| 150 mM NaCl | NaCl | 8.8 g |
| 工作溶液的組分，pH 7.5 | 成分 | 每升的量 |
|---|---|---|
| 20 mM Tris·Cl | Tris base | 2.4 g |
| 500 mM NaCl | NaCl | 29.2 g |
| 0.05% (v/v) Tween 20 | Tween 20 | 500 μl |
| 0.2% (v/v) Triton X-100 | Triton X-100 | 2 ml |
| 工作溶液的組分 | 成分 | 每升的量 |
|---|---|---|
| 10% (w/v)脫脂干奶粉溶解于TBS緩沖液 | 脫脂干奶粉溶解于TBS緩沖液 | 100 g |
| 替代品: 1% (w/v)堿溶性酪蛋白溶解于TBS緩沖液 | 堿溶性酪蛋白溶解于TBS緩沖液 | 10 g |
所有的孵育和洗脫步驟都應該在振動(dòng)式搖床或軌道式搖床上進(jìn)行。
- 在室溫下使用TBS緩沖液對膜進(jìn)行洗脫，每次10分鐘。
-
在室溫下使用封閉緩沖液與膜孵育1小時(shí)。
小貼士：需要使用塑料薄膜密封孵育容器，以避免蒸發(fā)作用。 - 在室溫下使用TBS–Tween/Triton緩沖液對膜洗脫兩次，每次10分鐘。
- 在室溫下使用TBS緩沖液對膜洗脫10分鐘。
-
在室溫下將膜與一抗溶液（使用封閉緩沖液按照1/1000–1/2000的比例稀釋一抗原液）共同孵育1小時(shí)。
小貼士：確保膜被抗體溶液完全覆蓋。一直保持膜的濕潤。
小貼士：為了減少對抗體體積的需求，可以使用塑料袋將膜密封。 - 在室溫下使用TBS–Tween/Triton緩沖液對膜洗脫兩次，每次10分鐘。
- 在室溫下使用TBS緩沖液對膜洗脫10分鐘。
-
在室溫下將膜與二抗稀釋液（含有10%脫脂奶粉和二抗的TBS緩沖液）共同孵育1小時(shí)。依照廠(chǎng)商建議對二抗進(jìn)行稀釋。
小貼士：請確保您所用的二抗直接對應于一抗的來(lái)源物種！
小貼士：奶粉能夠有助于減低本底，因為BSA不足以對極敏感的化學(xué)發(fā)光檢測法進(jìn)行完全封閉。
小貼士：使用最低的建議濃度，以避免產(chǎn)生假陽(yáng)性信號。 - 在室溫下使用TBS–Tween/Triton緩沖液對膜洗脫4次，每次10分鐘。
-
實(shí)施化學(xué)發(fā)光檢測反應，使用塑料薄膜將蛋白膜包裹，并依照廠(chǎng)商建議進(jìn)行X光底片的曝光。
小貼士：請確保您選擇了正確的化學(xué)發(fā)光檢測底物，例如對AP偶聯(lián)抗體使用AP底物，或對HRP偶聯(lián)抗體使用HRP底物。
小貼士：蛋白印跡膜可以使用塑料薄膜包裹并儲存于4°C。也可對蛋白印跡進(jìn)行脫抗體反應（stripping），再使用其它不同的抗體進(jìn)行檢測（5）。
使用顯色法進(jìn)行免疫檢測
所需材料
- 蛋白質(zhì)印跡
- TBS緩沖液
- TBS–Tween/Triton緩沖液
- 封閉緩沖液
- 一抗（蛋白特異性）原液
- 抗體–酶偶聯(lián)物原液
- 顯色底物
注意：使用顯色法的檢測過(guò)程中，封閉緩沖液和二抗稀釋液中均可使用3% BSA（重量體積比）。
| 顯色底物* | 縮寫(xiě) | 反應產(chǎn)物 |
|---|---|---|
| 過(guò)氧化物酶底物：3,3'-Diaminobenzidine | DAB | 棕色、不溶 |
| 過(guò)氧化物酶底物：3-Amino-9-ethylcarbazole | AEC | 紅色、不溶 |
| 過(guò)氧化物酶底物：4-Chloro-1-naphthol | 4C1N | 藍色、不溶 |
| 堿性磷酸酶底物：5-Bromo-4-chloro-3-indoylphosphate/Nitro blue tetrazolium | BCIP/NBT | 藍色、不溶 |
所有的孵育和洗脫步驟都應該在振動(dòng)式搖床或軌道式搖床上進(jìn)行。
-
1.
- 按照使用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行免疫檢測方案中的1–7步驟進(jìn)行實(shí)驗。
-
使用含有3% BSA（質(zhì)量體積比）的TBS緩沖液稀釋二抗，并在室溫下將膜與二抗溶液共同孵育1小時(shí)。遵照廠(chǎng)商建議進(jìn)行抗體稀釋。
小貼士：請確保您所使用的二抗直接對應于一抗的來(lái)源物種。
小貼士：使用最低的建議濃度，以避免產(chǎn)生假陽(yáng)性信號。 - 在室溫下使用TBS-Tween/Triton緩沖液對膜洗脫4次，每次10分鐘。
-
使用AP或HRP染色液對膜進(jìn)行染色，直至出現清晰的信號（大約5–15分鐘）。在顯色過(guò)程中不要振動(dòng)膜。
小貼士：請確保您選擇了正確的顯色底物，例如對AP偶聯(lián)抗體使用AP底物，或對HRP偶聯(lián)抗體使用HRP底物。 - 將膜用水漂洗兩次以中止顯色反應。
- 瀝干蛋白膜并盡快完成拍照，因為反應生成的顏色會(huì )隨時(shí)間減淡。HRP的顯色尤其不穩定。
酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）是一種與蛋白膜上免疫檢測類(lèi)似的方法，通常用于液相蛋白的定量檢測。在ELISA實(shí)驗中，蛋白被固著(zhù)于固相載體（例如96孔板的孔）上，作為俘獲分子與靶標蛋白進(jìn)行結合。通過(guò)洗滌去除非特異性結合之后，再加入針對靶標蛋白的二抗。二抗一般與酶相偶聯(lián)，從而可以通過(guò)顯色反應或化學(xué)發(fā)光法實(shí)現檢測。
在一種ELISA分析方法中，識別靶標蛋白上的抗原決定簇的特異性抗體被作為固定相，對所加入的檢測溶液進(jìn)行結合。固定的抗體將捕獲樣品中存在的靶蛋白。通過(guò)洗滌步驟去除非特異性的結合，之后加入二抗，與蛋白上的二抗原決定簇進(jìn)行結合。也可（另一方法）將蛋白固定于固相載體上，測試溶液中與蛋白相結合的抗體可以通過(guò)加入二抗來(lái)得到檢測和定量。
在96微孔板上包被蛋白用于ELISA檢測
該法被用來(lái)將蛋白固定于96微孔板的內表面。之后即可使用一抗和二抗，以類(lèi)似于蛋白質(zhì)印跡的方式對蛋白進(jìn)行分析。
開(kāi)始前的重要事項
- 與聚苯乙烯材質(zhì)結合的難易程度由特定蛋白的自身屬性所決定。對結合條件的優(yōu)化是必要的。請參考生產(chǎn)商提供的說(shuō)明書(shū)。
- 在實(shí)驗初始階段，應比較使用三種不同pH值的緩沖液。
- 在4–37°C進(jìn)行結合反應。成功的結合也受蛋白質(zhì)穩定性的影響。
所需材料
- 適當的96微孔板
包被緩沖液
PBS緩沖液，pH 7.2
50 mM 碳酸鈉，pH9.6
50 mM 碳酸鈉，pH10.6
微孔板封閉緩沖液
| 工作溶液的組分 | 成分 | 每升的量 |
|---|---|---|
| 50 mM磷酸鉀 |
0.5 M K2HPO4 0.5 M KH2PO4 |
71.7 ml 28.3 ml |
| 150 mM NaCl | NaCl | 8.8 g |
| 工作溶液的組分 | 成分 | 每升的量 |
|---|---|---|
| 50 mM Na2CO3 | Na2CO3·H2O | 6.2 g |
| 工作溶液的組分 | 成分 | 每升的量 |
|---|---|---|
| 50 mM Na2CO3 | Na2CO3·H2O | 6.2 g |
| 工作溶液的組分 | 成分 | 每升的量 |
|---|---|---|
| 2%蔗糖 | 蔗糖 | 20 g |
| 0.1% BSA | BSA | 1 g |
| 0.9% NaCl | NaCl |
- 使用包被緩沖液對需要固定的蛋白樣本倍比稀釋。
- 每孔加入200 μl蛋白溶液，在4°C下孵育過(guò)夜。
- 使用PBS緩沖液對每孔洗滌4次。每次對孔洗滌10–60秒，在紙巾上輕敲96孔板以控干水分。
-
在搖床上使用250 μl微板封閉緩沖液對孔內表面進(jìn)行2小時(shí)的室溫（20–25°C）封閉。
小貼士：封閉之后，96孔板可在20–25°C下干燥過(guò)夜，但檢驗的敏感性會(huì )下降。
小貼士：干燥之后，96孔板可暫時(shí)放置于4°C一段時(shí)間等待使用，不過(guò)實(shí)際效果還是依賴(lài)于所分析特定蛋白的自身屬性。 - 使用PBS緩沖液對每孔洗滌4次。每次對孔洗滌10–60秒，在紙巾上輕敲96孔板以控干水分。
- 按照實(shí)驗方案 使用蛋白特異性抗體進(jìn)行蛋白分析 進(jìn)行操作。
使用蛋白特異性抗體進(jìn)行蛋白分析
開(kāi)始前的重要事項
- 檢測抗體應在室溫下進(jìn)行至少1小時(shí)的結合反應。如果檢出的蛋白濃度非常低，或抗原決定簇被部分地遮蔽，進(jìn)行2–4小時(shí)或過(guò)夜的孵育可能會(huì )增加檢測靈敏度。
- 在搖床上進(jìn)行所有操作將有助于獲得最佳結果。如果無(wú)搖床可供使用，增加孵育時(shí)間（室溫增長(cháng)至2–3小時(shí)或在4°C下過(guò)夜）或孵育溫度可能有助于抗體的充分擴散。
- 抗體稀釋方法主要視所使用的具體抗體而定。請參考廠(chǎng)商建議，或以蛋白質(zhì)印跡或斑點(diǎn)印跡分析的有效濃度開(kāi)始，嘗試使用進(jìn)一步稀釋的樣本。使用0.1 μg/ml濃度至1 μg/ml的第一單克隆抗體濃度，通?？色@滿(mǎn)意效果。對每個(gè)抗體都可在此濃度區間進(jìn)行滴定檢測，以確定最佳的稀釋濃度。
- 適當的陰性對照是必不可少的。分析應一直與不含任何蛋白（單獨的裂解液/稀釋液，空白試劑）或缺乏靶蛋白（例如使用空白載體（無(wú)蛋白編碼片段插入）轉化的大腸桿菌裂解產(chǎn)物）的樣本平行進(jìn)行。這些對照都需要與抗體及其后的分析組分進(jìn)行孵育。注意：本實(shí)驗方案僅設定為一個(gè)具體案例。單個(gè)蛋白和抗體的最佳條件應該進(jìn)行針對性的測定。
- 如要建立一個(gè)新的分析體系，應首先針對蛋白或抗體與固相之間的結合效果進(jìn)行優(yōu)化（孵育時(shí)間和蛋白用量）。分析中的一抗或其他二級組分在之后進(jìn)行優(yōu)化。
所需材料
- 完成蛋白包被的微型96孔板
- PBS/BSA
- PBS
- 靶蛋白的特異性抗體
- 二抗偶聯(lián)物
- 堿性磷酸酶底物，或辣根過(guò)氧化酶某一替代性底物。關(guān)于底物的更詳盡資料請參見(jiàn)表 蛋白質(zhì)分析中蛋白底物的詳細資料。
| 工作溶液的組分 | 成分 | 每升的量 |
|---|---|---|
| 0.2% BSA in PBS | BSA溶于PBS | 2 g |
| 成分 | Volume |
|---|---|
| 0.2 M Na2HPO4 | 251.5 ml |
| 0.1 M檸檬酸 | 48.5 ml |
| 成分 | 量 |
|---|---|
| pNPP | 50 mg |
| 1 M二乙醇胺; 0.01% MgCl2·6 H2O, pH 9.8 | 10 ml |
| 成分 | 量 |
|---|---|
| ABTS | 10 mg |
| 磷酸–檸檬酸緩沖液 | 10 ml |
| 在使用前加入30% H2O2 | 2 μl |
| 成分 | 量 |
|---|---|
| OPD | 10 mg |
| 磷酸–檸檬酸緩沖液 | 10 ml |
| 在使用前加入30% H2O2 | 2 μl |
| 成分 | 量 |
|---|---|
| TMB | 10 mg |
| DMSO | 1 ml |
| 溶解，之后加入磷酸–檸檬酸緩沖液 | 9 ml |
-
使用PBS/BSA以1/2000比例稀釋靶蛋白特異性的抗體，加入200 μl抗體稀釋液。蓋上96孔板并在室溫下孵育1–2小時(shí)。
為了提高靈敏度，抗體可于4°C下孵育過(guò)夜。 - 使用PBS–Tween緩沖液對每孔洗滌4次。每次對孔洗滌10–60秒，清洗后在紙巾上小心輕敲96孔板以控干水分。
- 按照廠(chǎng)商建議使用PBS/BSA緩沖液稀釋二抗。每孔加入200 μl抗體稀釋液并于室溫下孵育45分鐘。
- 使用PBS–Tween緩沖液對每孔洗滌4次。每次對孔洗滌10–60秒，清洗后在紙巾上小心輕敲96孔板以控干水分。
-
加入200 μl底物溶液，在酶標儀中監控顏色變化。
注意：底物溶液需現配現用。
小貼士：在45分鐘內監視顏色變化，或于特定時(shí)間加入50 μl終止試劑并檢測產(chǎn)物。當檢測一個(gè)新的分析系統時(shí)，需要對整個(gè)顯色反應的時(shí)間進(jìn)程進(jìn)行觀(guān)察，以確定最優(yōu)的顯色時(shí)間和溫度。
小貼士：如果顯色反應已經(jīng)終止，底物的信號強度將會(huì )略微增加（基于所使用的具體底物），生成的顏色將在一定時(shí)間內保持穩定。
Bradford法是一種定量蛋白的測定方法，該法基于考馬氏亮藍染料與蛋白樣品的結合反應，通過(guò)使用已知數量的標準蛋白（一般使用BSA）建立標準曲線(xiàn)，再將樣品的顯色強度與標準曲線(xiàn)進(jìn)行比較來(lái)完成定量。
在這一檢測中，蛋白樣品需要使用適當的緩沖液進(jìn)行稀釋?zhuān)ㄍǔ＜词褂盟鼈兊娜芙庖海?。同時(shí)也應該使用相同的緩沖液建立BSA（牛血清清蛋白）標準曲線(xiàn)。
所需材料
- BSA標準溶液(1 mg/ml)
- Bradford分析染料（市售產(chǎn)品，如Bio–Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate，產(chǎn)品號500–0006）
- 蛋白稀釋緩沖液
注意：應使用蛋白樣品的溶解體系進(jìn)行進(jìn)一步稀釋。請使用同種緩沖體系建立標準曲線(xiàn)。
注意： BSA標準液的濃度應使用光度計進(jìn)行測定。1 mg/ml BSA溶液的A280值應為0.66。
- 制備標準曲線(xiàn)時(shí)，需按照表格“用于Bradford蛋白測定的標準曲線(xiàn)樣品”中所列出的溶液體積對BSA進(jìn)行小心混勻，對應的標準品濃度分別為0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 mg/ml BSA。所有樣品的體積均為200 μl。
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將染料分裝，并使用蒸餾水以1:5的比例進(jìn)行稀釋。將每份BSA稀釋液各吸取20 μl至一塑料試管內，再加入1 ml稀釋后的染料混勻，并于室溫下孵育5分鐘。
注意：在避光保存的條件下，稀釋后的染料在2周之內保持穩定。在保存瓶上記下制備日期，并以鋁箔覆蓋。 - 測量每個(gè)樣品在595 nm處的OD值，并以此繪制標準曲線(xiàn)。
- 制備第二標準曲線(xiàn)時(shí)，需按照表格“用于Bradford蛋白測定的標準曲線(xiàn)樣品”中所列出的溶液體積對BSA進(jìn)行小心混勻，對應的標準品濃度分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8和1 mg/ml BSA。所有樣品的體積均為200 μl。
- 將染料分裝，并使用蒸餾水以1:5的比例進(jìn)行稀釋。將每份BSA稀釋液各吸取20 μl至一塑料試管內，再加入1 ml稀釋后的染料混勻，并于室溫下孵育5分鐘。
- 測量每個(gè)樣品在595 nm處的OD值，并以此繪制標準曲線(xiàn)。
- 制備靶蛋白樣品的稀釋液，并取2份20 μl稀釋液樣本，按照上述方法進(jìn)行測定。精確按照生成標準曲線(xiàn)的樣品制備方法對測試蛋白樣品進(jìn)行處理是十分重要的。通過(guò)與標準曲線(xiàn)上的OD595數值進(jìn)行比較來(lái)計算測試樣本的蛋白濃度，并按照稀釋比例還原真實(shí)濃度。
| BSA濃度(mg/ml) | BSA標準溶液的體積(μl) | 蛋白質(zhì)梯度稀釋液體積(μl)* |
|---|---|---|
| 0 | – | 200 |
| 0.05 | 10 | 190 |
| 0.1 | 20 | 180 |
| 0.2 | 40 | 160 |
| 0.3 | 60 | 140 |
| 0.4 | 80 | 120 |
| 0.5 | 100 | 100 |
| 0.6 | 120 | 80 |
| 0.8 | 160 | 40 |
| 1.0 | 200 | – |
- International Human Genome Sequencing Consortium (2004) Finishing the euchromatic sequence of the human genome. Nature. 431, 931.
- Jensen, O.N. (2004) Modification-specific proteomics: Characterization of post-translational modifications by mass spectrometry. Curr. Opin. Chem. Biol. 8, 33.
- Ausubel, F.M., et al. (1999) Current Protocols in Molecular Biology. New York: John Wiley and Sons.
- Sambrook, J. and Russell, D. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory.
- Kaufmann S.H., Ewing, C.M., and Shaper, J.H. (1987) The erasable Western blot. Anal. Biochem. 161, 89.
