基于亞硫酸氫鹽轉化的DNA甲基化分析

將DNA暴露在亞硫酸氫鹽中能導致未甲基化的胞嘧啶迅速的脫氨基轉換成6-磺?；遴奏?。在高pH值情況下，6-磺?；遴奏?huì )脫磺?；D變成脲嘧啶并最終通過(guò)序列擴增轉換成胸腺嘧啶。而甲基化的胞嘧啶不會(huì )發(fā)生這種轉變。將這種轉化過(guò)的DNA與初始的未轉化的序列進(jìn)行比對，能確定CpG島上甲基化位點(diǎn)的位置和豐度的細節。高分辨率溶解分析（HRM）是一種快速的篩選工具，能精確的檢測亞硫酸氫鹽轉化的DNA上的CpG島甲基化狀態(tài)的變化。Pyrosequencing能定量的描述單個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化的百分比?？捎糜诖蟪叨燃谆治龅钠渌晒┨娲姆椒ㄟ€包括甲基化特異性PCR（MSP），這種方法具有較高的特異性和靈敏度。這些分析方法都有商業(yè)化的試劑盒。

基于限制性酶消化的DNA甲基化分析

這種方法可以不使用亞硫酸氫鹽修飾而研究單獨基因上或者疾病或通路相關(guān)的基因panel上的CpG島的甲基化狀態(tài)。這種方法依賴(lài)于兩種不同的限制性?xún)惹忻笇τ谀繕诵蛄胁煌募羟蟹绞?。這兩種酶在發(fā)揮其生物活性時(shí)，對各自識別序列中是否有甲基化胞嘧啶的要求不同。每一種酶消化之后殘留的DNA的相對量可以通過(guò)real-time PCR進(jìn)行定量分析，從而得到單獨基因甲基化狀態(tài)以及gene panel的甲基化情形的可靠計算數據。

表觀(guān)遺傳學(xué)相關(guān)的DNA-蛋白相互作用的體內分析

染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)方法是分析活細胞中染色質(zhì)DNA與轉錄因子、共調節因子、修飾組蛋白、染色質(zhì)重塑蛋白以及其它核因子相互作用的強大的多功能方法。這種方法可用于對DNA–核蛋白的動(dòng)態(tài)相互作用進(jìn)行活體分析。這種相互作用在表觀(guān)遺傳學(xué)中的基因表達調控中起到了非常重要的作用。

一種新型的表觀(guān)遺傳學(xué)標志物：5-羥甲基胞嘧啶(5 hmC)

5-羥甲基胞嘧啶是哺乳動(dòng)物基因組DNA中一種重要的表觀(guān)遺傳學(xué)標志物。5-羥甲基胞嘧啶是最近才發(fā)現的一種堿基修飾。它是經(jīng)TET加氧酶家族（1，2）催化5-甲基胞嘧啶形成的。

它被稱(chēng)為“第六種DNA堿基”，關(guān)于這種堿基的所扮演的角色有很多推測，但是它的準確的生物學(xué)功能還沒(méi)有闡明。初步的結果認為5-羥甲基胞嘧啶可能具有與5-甲基胞嘧啶不同的重要功能。目前的證據顯示5-羥甲基胞嘧啶可能代表了一種DNA去甲基化的新途徑，這種途徑涉及到將羥甲基化胞嘧啶轉換成胞嘧啶的修復機制。這可能在表觀(guān)遺傳學(xué)領(lǐng)域有非常重要的含義，能加速表觀(guān)遺傳學(xué)的研究。

甲基化特異性PCR（MSP）的引物設計

甲基化特異性PCR（MSP）是一種要求很高的應用。為了得到可靠的結果，它要求能高度特異性的區分胞嘧啶和亞硫酸氫鹽轉化試驗中由甲基化和未甲基化的胞嘧啶轉化得到的胸腺嘧啶。

甲基化特異性PCR的引物設計通常比較困難，因為這種引物的設計要求覆蓋幾個(gè)CpG位點(diǎn)。這樣就不能檢測CpG島里面單獨的CpG甲基化。

引物在其序列里面需要包含至少一個(gè)CpG位點(diǎn)，并且最好位于它們的序列中遠離3’端的位置，以便能最大程度的區分甲基化和未甲基化的DNA。

引物在其序列中應該包含足夠的不位于CpG島上的胞嘧啶，以便僅擴增那些被亞硫酸氫鹽修飾過(guò)的DNA。包含有更多的不位于CpG島上的胞嘧啶的引物更加適用。

甲基化DNA（M pair）和未甲基化DNA（U pair）的引物應該在其序列中包含相同的CpG位點(diǎn)。比如，M pair的正向引物包含這樣的序列：ATTAGTTTCGTTTAAGGTTCGA，那么U pair的正向引物必須也包含這兩個(gè)CpG位點(diǎn)，比如，ATTAGTTTTGTTTAAGGTTTGA；盡管它們可能在長(cháng)度和起始位點(diǎn)上有差別。M pair和U pair最好具有相似的退火溫度。

對照DNA

在進(jìn)行甲基化分析的時(shí)候，應該進(jìn)行對照試驗，比如，在進(jìn)行甲基化特異性PCR（MSP）時(shí)，應該保證PCR的引物能特異性的檢測亞硫酸氫鹽轉化的甲基化和未甲基化的DNA。

為了進(jìn)行對照實(shí)驗，需要亞硫酸氫鹽轉化的甲基化的DNA、亞硫酸氫鹽轉化的未甲基化的DNA和基因組DNA。應該使用每一種類(lèi)型的DNA來(lái)判斷PCR的特異性。比如，甲基化DNA特異性的引物對于甲基化的對照DNA僅顯示一個(gè)信號（參見(jiàn)下表）。

除此之外，基因組DNA還可用于測定亞硫酸氫鹽反應中亞硫酸氫鹽轉化的效率。

參考文獻

1. Kriaucionis, S., and Heintz, N. (2009) The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science 324, 929.
2. Tahiliani, M., et al. (2009) Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science 324, 930.
3. Ito, S., et al. (2010) Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification., Nature 26, 1129.
4. Jin, S.G., Kadam, S., and Pfeifer, G.P. (2010) Examination of the specificity of DNA methylation profiling techniques towards 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine. Nucleic Acids Res. 38, e125.
5. Huang, Y., et al. (2010) The behaviour of 5-hydroxymethylcytosine in bisulfite sequencing. PLoS One 26, e8888.
6. Nestor, C., et al. (2010) Enzymatic approaches and bisulfite sequencing cannot distinguish between 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine in DNA. Biotechniques 48, 317.