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基于PCR的全基因組擴增

有三種主要的基于PCR的WGA技術(shù)。它們分別是簡(jiǎn)并寡聚核苷酸PCR（DOP–PCR）（1），引物延伸預擴增（PEP）（2）或者相關(guān)的衍生方法，以及適配子連接PCR。這些技術(shù)之間的主要區別是，PEP技術(shù)使用預擴增步驟將引物結合位點(diǎn)加到DNA片段上去，以用于后續的WGA實(shí)驗，而適配子連接PCR使用連接到DNA片段上的適配子做為PCR的引物結合位點(diǎn)。PEP技術(shù)使用隨機的引物和較低的PCR退火溫度。DOP–PCR技術(shù)使用半簡(jiǎn)并的寡聚核苷酸（即CGACTCGAGNNNNNNATGTGG）和較高的退火溫度，但是這種技術(shù)目前已經(jīng)很少使用了。在這兩種技術(shù)中使用的Taq DNA聚合酶，將片段大小限制在3 kb（平均的片段大小是400–500個(gè)核苷酸大?。?，并且在序列中引入了很多錯誤。除此之外，已經(jīng)發(fā)現這些技術(shù)不能完整地覆蓋基因組，并且擴增是偏性的——在擴增的DNA中，一個(gè)序列的特定區域可能與引物優(yōu)先結合而導致其被高估。

多重置換擴增WGA

多重置換擴增（MDA）使用隨機六聚物與變性的DNA結合，然后在恒定的溫度下，使用Phi29聚合酶進(jìn)行鏈置換合成。在每一條被置換的鏈上發(fā)生的額外的引導事件，可能會(huì )產(chǎn)生分支DNA結構。

由于Phi29聚合酶不從基因組DNA模板上解離，使得生成的DNA片段能延長(cháng)到100 kb左右，并且序列是無(wú)偏差的。這個(gè)酶具有3’–5’的核酸外切酶標定活性，其錯誤率比基于Taq DNA聚合酶的方法低大約1000倍。

基于PCR的WGA方法（比如，PEP和適配子連接PCR）會(huì )受到DNA二級結構的影響。這些結構會(huì )導致酶滑序（4）或者從模板上解離，從而導致出現非特異性的擴增產(chǎn)物，不能完整覆蓋遺傳位點(diǎn)和不能用于下游分析的短DNA片段（短于1 kb）（5）。與此相反，鏈置換聚合酶Phi29消除了DNA的二級結構，因而能夠準確并且均勻的擴增基因組序列。使用高度續進(jìn)性的Phi29聚合酶得到的長(cháng)DNA片段，確保了Phi29擴增得到的DNA覆蓋了整個(gè)基因組，連貫并且無(wú)偏地擴增所有遺傳位點(diǎn)。

無(wú)偏差的擴增

使用高度續進(jìn)性的Phi29聚合酶得到的長(cháng)DNA片段確保了Phi29擴增得到的DNA覆蓋了整個(gè)基因組，連貫并且無(wú)偏地擴增所有遺傳位點(diǎn)。

在有偏的研究中，使用MDA、DOP–PCR和PEP技術(shù)對不同數量的基因組DNA進(jìn)行擴增（0.3–300 ng）。使用定量檢測real-time PCR確定8個(gè)遺傳位點(diǎn)相對的表達量。通過(guò)與1 μg未擴增的對照DNA作比較，可以確定遺傳位點(diǎn)的表達。

由于未消除的二級結構會(huì )導致不同位點(diǎn)的不等同擴增，基于PCR的WGA方法（比如DOP–PCR或者PEP）經(jīng)常會(huì )導致遺傳位點(diǎn)丟失。MDA具有最好的DNA擴增覆蓋效果，并且將遺傳位點(diǎn)丟失的風(fēng)險降到了最低。

WGA中DNA變性的重要性

完整的長(cháng)片段DNA能保證下游實(shí)驗的高敏感性，是成功的WGA實(shí)驗的理想模板。使用擴增的，片段化的DNA的實(shí)驗，其敏感性和可靠性較差，這是由于靶標位點(diǎn)的DNA斷裂風(fēng)險增大。為了得到最佳的結果，模板DNA充分變性非常重要。但是在95°C條件下的熱變性會(huì )損傷模板DNA，導致不完整的和連貫性較差的遺傳位點(diǎn)呈遞。堿性條件下的DNA變性回避了這些問(wèn)題，以保證擴增覆蓋整個(gè)基因組，并具有一致性和最低的序列偏倚。

應該避免DNA在95°C環(huán)境下的變性，因為這不僅會(huì )影響位點(diǎn)覆蓋，而且會(huì )使Phi29從DNA模板上永久的解離下來(lái)，而影響MDA擴增得到的DNA產(chǎn)物的長(cháng)度。通常而言，Phi29聚合酶能夠復制長(cháng)達100 kb的序列，而不從基因組DNA模板上解離下來(lái)。使用MDA擴增得到的DNA產(chǎn)物的大小的在2 kb至100 kb范圍內，平均長(cháng)度超過(guò)10 kb。因此，MDA擴增技術(shù)得到的DNA，對于需要長(cháng)DNA片段的下游應用是非常理想的（比如RELP分析和Southern印跡）。

單細胞WGA

為了確保單細胞WGA使用了完整的基因組，應該在WGA反應中加入未受損的完整細胞。由于每一個(gè)DNA的斷裂都會(huì )導致該位點(diǎn)的序列信息丟失，MDA是擴增整個(gè)基因組的最合適的方法。這一反應可用于全基因組擴增實(shí)驗，是由于Phi29聚合酶能夠復制長(cháng)達100 kb的序列，而不從基因組DNA模板上解離下來(lái)。

在一項研究中，使用MDA技術(shù)擴增單個(gè)細胞的基因組DNA（3個(gè)復本）。在單細胞WGA實(shí)驗中，大約產(chǎn)生了40 μg DNA。將單細胞WGA實(shí)驗得到的DNA與1000個(gè)細胞的WGA實(shí)驗得到的DNA，以及未擴增的全基因組測序DNA相比較。全基因組測序使用2 μg DNA，并使用illumina MiSeq儀器進(jìn)行（WGA–DNA或者未擴增的基因組DNA）。gDNA和單細胞擴增的DNA具有相似的序列覆蓋度。未擴增的和REPLI–g擴增的DNA具有非常低的，相似的錯誤率。

處理片段化的DNA

MDA技術(shù)要求基因組DNA片段的平均長(cháng)度大約為2 kb，以便無(wú)偏差的擴增DNA。盡管可以將片段連接起來(lái)得到更長(cháng)的DNA，只要一些DNA片段的長(cháng)度大于2 kb，片段化的DNA和低質(zhì)量的DNA也能使用。這是因為隨機片段化的DNA包含了所有位點(diǎn)的多個(gè)無(wú)損的拷貝。但是為了保證對位點(diǎn)的精確覆蓋，應該增加模板DNA的起始量。

處理固定的組織樣本：FFPE組織中的DNA

福爾馬林固定是在石蠟包埋（FFPE）中保存組織樣本的最常用的技術(shù)。這種技術(shù)通過(guò)交聯(lián)生物分子，確保組織的結構和細胞的形態(tài)被保留下來(lái)。不同的組織類(lèi)型需要不同的固定流程：柔軟連續的組織，比如乳房組織樣本，通常需要較長(cháng)的固定步驟以保存組織形態(tài)。更長(cháng)的固定時(shí)間可能會(huì )導致兩個(gè)結果：

• 生物分子之間的交聯(lián)程度更高
• DNA的破碎程度更高——導致幾百個(gè)堿基長(cháng)度的小DNA片段

DNA的片段化減少了PCR可以檢測到的基因組的量，因此對下游的實(shí)驗具有很大影響。

盡管目前沒(méi)有簡(jiǎn)單的方法能確定樣本中的交聯(lián)程度，對FFPE樣本中分離出來(lái)的DNA進(jìn)行凝膠電泳能給出關(guān)于DNA的質(zhì)量的有價(jià)值的線(xiàn)索。

影響基于PCR的分析和后續的MDA實(shí)驗的關(guān)鍵因素

使用PCR技術(shù)從石蠟包埋組織中檢測特定的遺傳位點(diǎn)受到以下因素的影響：

• 拷貝數
• 交聯(lián)程度
• 擴增子大小

拷貝數：DNA的量越多，基因組的拷貝數目也越多，經(jīng)過(guò)整個(gè)基因組擴增之后，PCR檢測到特定遺傳位點(diǎn)位的可能性也就越大。但是，石蠟包埋樣本中DNA的定量檢測會(huì )受到與DNA共同分離出來(lái)的很多污染物的影響。使用紫外光掃描法能確定污染物。相反的，單獨測定260 nm處的吸光度（A₂₆₀），而不使用紫外光掃描（220到320 nm范圍內的吸光度），會(huì )高估DNA的濃度。高估PCR或者其他下游實(shí)驗中輸入的DNA的量，可能會(huì )觀(guān)察到比較差的結果。

交聯(lián)：DNA樣本的交聯(lián)程度越高，擴增反應（比如全基因組擴增）的結果越差。

擴增子大?。?/strong>基于PCR分析FFPE處理的DNA時(shí)，所用到的擴增子越小，檢測到特定的遺傳位點(diǎn)的可能性越大。完整的DNA的real-time PCR 實(shí)驗與石蠟組織包埋的樣本實(shí)驗比較說(shuō)明，增大擴增子會(huì )顯著(zhù)降低可檢測的基因組的數量。