NGS 序列
二代測序儀器有很多種組合，在通量、片段長(cháng)度、準確度、每一輪測序成本、每百萬(wàn)堿基對測序成本、初始成本、規格和技術(shù)方面存在存在差異。 
從規格和初始成本的角度而言，二代測序儀器可輕松地分類(lèi)為更窄的范圍，也就是所謂的“臺式測序儀”和高通量?jì)x器。
臺式測序儀使得任何實(shí)驗室都可以像使用real-time PCR一樣，自己進(jìn)行測序。這些儀器可以和一些靶標序列富集技術(shù)相結合，用在一些臨床的應用中，其中：選定的靶標基因用于深度分析，以檢測稀有的突變，或者檢測多樣樣本中（比如癌癥樣本）中的突變。目前，這些儀器的通量在10 Mb到7.5 Gb之間，但是隨著(zhù)硬件，軟件和試劑的持續改善，通量也在穩步增加。
高通量測序儀非常適合于大量的，基因組范圍的研究，每次測序能測定600 Gb的序列。一些這樣的高通量和高精度的平臺，能測定的片段長(cháng)度相對較短，這對于高重復性的序列和未知基因組的從頭測序就可能成為問(wèn)題。與此相反，也有一些儀器能測序的片段較長(cháng)（達到2500 bp），但是其精度和測序能力（90 Mb）要低很多。還有一些測序能力位于兩者之間的儀器（~800 bp，700 Mb）。
因此，應用決定了哪一種儀器是最合適的。
有一種新的方法被稱(chēng)作“納米孔測序”。這種技術(shù)中，根據一個(gè)DNA鏈通過(guò)一個(gè)合成的或者蛋白納米孔道所引起的電流的改變，可以確定通過(guò)這個(gè)孔道的堿基。這理論上可以?xún)H用一步就測序一個(gè)完整的染色體，而不需要生成新的DNA鏈。
DNA測序
二代DNA測序的工作流程如下：

• DNA樣本制備
• 文庫構建和驗證
• 文庫分子大規模平行克隆擴增
• 測序

 
二代測序DNA樣本的質(zhì)量控制
首先，評價(jià)基因組DNA的質(zhì)量是非常必要的（完整性和純度）。
凝膠電泳法
基因組DNA的完整性和大小，可以用常規或者脈沖場(chǎng)瓊脂糖凝膠電泳(PFGE)來(lái)檢測。常規的凝膠電泳的精確度不高，這是因為大的DNA分子在凝膠中移動(dòng)的時(shí)候，本質(zhì)上是用一種與尺寸無(wú)關(guān)的方式一起移動(dòng)的。但是，它仍然能夠提供完整性（大小范圍）和純度（RNA污染物在凝膠底部形成脫尾條帶）方面的有效信息。因此，它仍然是評價(jià)基因組DNA質(zhì)量的有效方法之一。
注：RNA污染會(huì )導致DNA濃度高估，并且抑制一些下游步驟。如果能肯定有RNA污染，則可使用去DNase的RNase I處理樣本。
分光光度測定法
分光光度儀在260 nm和280 nm處讀數的比例（A₂₆₀/A₂₈₀）可以用來(lái)估計DNA相對于一些吸收紫外光的雜質(zhì)（比如蛋白）的純度。純凈的DNA的A₂₆₀/A₂₈₀比例大約為1.7–1.9。
注：想要獲得精確的A260/A280值，需要在弱堿性的緩沖溶液中測定吸光度(比如, 10 mM Tris?Cl, pH 7.5)。
第二個(gè)步驟是測定基因組DNA的濃度。
分光光度法
DNA的濃度可以通過(guò)使用分光光度儀測定其在260 nm波長(cháng)的吸光度來(lái)確定。Nanodrop目前被廣泛使用，因為它需要的樣本量少(1 μl)，并且使用方便（不需要比色皿）。為了確保結果的可靠性，讀數應該在0.1到1.0之間。 
注：吸光度測定不能區別DNA和RNA。RNA污染物會(huì )導致DNA濃度高估。但是，純凈RNA的A₂₆₀/A₂₈₀比值在2.0左右，而純凈的DNA大約為1.8。因此，如果這個(gè)值為1.95，那么說(shuō)明樣本里面有RNA雜質(zhì)。
注：苯酚在270–275 nm的波長(cháng)范圍內有最大的吸光度，非常接近于DNA。因此苯酚能提高樣本在260 nm附近的吸光度，從而導致高估DNA的產(chǎn)量和純度。
熒光法
熒光法使用熒光染料測定DNA的濃度，具有特異性和靈敏性。Hoechst 33258結合到DNA上后，能增大458 nm波長(cháng)附近的發(fā)光強度，除此之外，也可以使用一些更加靈敏的熒光染料，比如PicoGreen染料?；赑icoGreen染料的實(shí)驗，比紫外吸光光度法靈敏10，000倍，而比使用Hoechst 33258染料的方法至少靈敏400倍。和紫外吸光光度法不同，PicoGreen實(shí)驗對雙鏈DNA的選擇性要遠高于RNA和單鏈DNA。
DNA標準品和樣本與熒光染料混合，并且使用熒光計檢測。將樣本的測定結果與標準品的測定結果相比較，以確定DNA的濃度。
Real-time PCR 
可以使用real-time PCR 技術(shù)來(lái)測定DNA樣本的數量和質(zhì)量。多重PCR技術(shù)使用引物集在多個(gè)位點(diǎn)擴增不同大小的片段，是檢測DNA損傷和片段化的有效質(zhì)控手段。此類(lèi)技術(shù)試驗專(zhuān)門(mén)測定可經(jīng)PCR擴增，適于二代測序的DNA分子。上述提到的這些常規方法，通常不能測定的樣本中擴增得到的DNA的量，或者會(huì )高估了DNA的量。與它們相比，real-time PCR更加適用于預測DNA樣本是否適合于二代測序。 
文庫制備
對于大多數商業(yè)化的二代測序平臺，使用諸如橋式擴增或者乳液PCR方法，對文庫中的DNA片段進(jìn)行克隆擴增，以產(chǎn)生足夠拷貝數量的測序模板非常必要。通過(guò)將平臺特異性的適配子與感興趣的DNA源（比如基因組DNA、雙鏈cDNA或者PCR擴增子等所產(chǎn)生的DNA片段）退火，得到片段文庫。適配子序列的存在，使得我們可以對文庫分子進(jìn)行選擇性的克隆擴增。因此，這種方法不需要像傳統的方法那樣，在微生物中間體中，對基因組片段進(jìn)行微生物克隆。另外，適配子序列中，還含有平臺特異性的測序引物的結合位點(diǎn)。
通常情況下，一個(gè)常規的DNA文庫構建方案包含四步：

• 片段化DNA
• 對DNA片段進(jìn)行末端修復
• 連接適配子序列（不適用于單分子測序）
• 對可選的文庫進(jìn)行擴增

 
目前有四種方法用于產(chǎn)生基因組DNA碎片：酶消化法、超聲波法、噴霧法和水動(dòng)力剪切法。這四種方法都可以用于文庫構建，但是每一種方法都有其優(yōu)點(diǎn)和局限性。核酸內切酶消化的方法快速并且容易，但是難以精確的控制片段長(cháng)度的分布。另外這種方法可能會(huì )對基因組DNA的呈遞引入偏倚。另外三種技術(shù)使用物理的方法將DNA的雙鏈打斷，這種斷裂是隨機的，因此能在文庫中對DNA進(jìn)行無(wú)偏的呈遞?？梢允褂铆傊悄z電泳或者自動(dòng)化的DNA分析方法，對DNA片段的尺寸分布進(jìn)行控制。
片段化DNA之后，需要將DNA修復，產(chǎn)生5’磷酸化的平末端DNA，以便能夠和測序平臺特異性的適配子相連接。文庫構建的效率直接依賴(lài)于DNA末端修復的效率和準確性。
末端修復混合溶液將5’或者3’的粘性末端轉變成5’磷酸化的平末端DNA。在大多數情況下，末端修復通過(guò)T4 DNA聚合酶的5’—3’聚合酶活性和3’—5’的核酸外切酶活性完成。而T4多聚核苷酸激酶確保平末端的DNA片段5’端的磷酸化，以便進(jìn)行后續的適配子連接。
根據所使用的測序平臺，平末端DNA片段可以直接與適配子連接，或者需要在其片段的3’端增加一個(gè)單獨的突出的腺苷酸A，以便與平臺特異性適配子上突出的胸苷酸T相互配對。通常情況下，使用Klenow片段（具有最低的3’到5’端的核酸外切酶活性），或者使用其它具有末端轉移酶活性的聚合酶催化這一步驟。
T4 DNA連接酶將雙鏈的適配子與文庫片段修復過(guò)的末端相連，然后使用回收反應或者根據DNA的尺寸，選擇性去除文庫中未連接的適配子和適配子二聚體。大小篩選方法包括使用瓊脂糖凝膠電泳分離，使用磁珠或者使用高等的基于柱的純化方法。在連接過(guò)程中可能出現適配子的二聚體，它們會(huì )和與適配子連接的文庫片段共同擴增，從而降低測序平臺對真正文庫片段測序的能力并且降低測序的質(zhì)量，因此在測序之前，必須將它們從文庫中除去。一些測序平臺要求文庫片段的長(cháng)度分布在比較窄的范圍內，以得到最佳的結果，很多時(shí)候，這只能通過(guò)去除凝膠電泳上的相應的片段條帶實(shí)現。這種方法也可以用來(lái)去除適配子二聚體。
完成這一步驟之后，應該對DNA片段文庫的質(zhì)量進(jìn)行檢測，并進(jìn)行定量檢測。根據濃度和測序文庫的適配子設計，既可以直接稀釋溶液并用于測序，也可以對文庫進(jìn)行選擇性擴增。在文庫擴增階段，使用高保真的DNA聚合酶，合成完整的適配子序列，通過(guò)與PCR引物的重疊，用于后續的克隆擴增和與測序引物結合，或者提高DNA文庫的產(chǎn)量。為了得到最佳的文庫擴增結果，要求DNA聚合酶具有高保真性和最小的序列偏倚。
文庫質(zhì)量評估方法，參見(jiàn)NGS文庫質(zhì)控。
為了充分利用測序能力，不同樣本得到的測序文庫可以放在一起，在同一輪實(shí)驗中一同測序。通過(guò)將DNA片段與具有不同特征的適配子相連接，可以實(shí)現這一過(guò)程，即對于每一個(gè)樣本使用不同的短核苷酸序列作為適配子。
有一些其它的方法可以用于簡(jiǎn)化文庫構建。有一種新方法使用轉位酶/DNA的復合物進(jìn)行體外轉座，以便在同一個(gè)試管中同時(shí)將DNA片段化并標記。通過(guò)對所標記的DNA片段進(jìn)行有限次數的PCR擴增，可以構建完整的測序文庫，這節省了操作步驟和時(shí)間。但是，使用體外轉座構建的文庫，與傳統方法構建的文庫相比，具有更高的序列偏倚。
NGS文庫質(zhì)控
高質(zhì)量的文庫是成功進(jìn)行第二代測序的關(guān)鍵。文庫構建包含復雜的步驟，比如片段化樣本、修復末端、將末端腺苷?；?、連接適配子和擴增文庫。根據使用的平臺和文庫類(lèi)型，這些步驟也會(huì )發(fā)生變化。監控每一個(gè)步驟非常必要，包括在片段化樣本之后檢查片段的尺寸，以及連接適配子之后檢查片段的大小和濃度。文庫驗證過(guò)程中，需要分析文庫中片段的大小和數量，這是質(zhì)控的最后步驟。
評估文庫中片段的大小
瓊脂糖和PAGE凝膠電泳是傳統的檢測片段大小的方法，它們比較耗時(shí)。 
最近，基于微流技術(shù)的電泳或者毛細管電泳越來(lái)越廣泛的用于檢測片段的大小和濃度。即買(mǎi)即用的芯片和膠盒省去了配置凝膠的步驟，使用方便。它們具有更高的通量，并且省去了很多的手動(dòng)操作時(shí)間。除此之外，它們的靈敏度更高（對于檢測的限制更少），并且能完全自動(dòng)化的獲取數據和輸出電子化的數據資料。這些儀器能同時(shí)檢測片段的大小和濃度。

• 測定文庫中的片段數量
• 分光光度法和熒光法
• 參見(jiàn)分光光度法和熒光法

電泳設備 
如前所述，基于微流技術(shù)的電泳和毛細管電泳除了提供片段大小的信息之外，還提供了定量檢測數據。但是，電泳、分光光度法和熒光法的一個(gè)共同的局限性是，都只檢測總的核苷酸的濃度，而非與適配子連接的分子的濃度。
Real-time PCR 
將適配子連接到文庫分子的兩端，使得可以在平行的PCR擴增步驟中擴增上百萬(wàn)個(gè)獨立的DNA分子（乳液PCR或者橋式PCR）。在有些儀器中，乳液PCR可以將一個(gè)DNA分子擴增到數百萬(wàn)個(gè)相同序列的拷貝，并全都結合在同一個(gè)珠子上。在另一種平臺上，橋式PCR能夠將一個(gè)DNA分子轉變成一個(gè)包含相同序列的多個(gè)拷貝的DNA簇。因此，兩端連接了適配子的擴增之后的分子，決定了乳液PCR中模板和珠子的比例以及橋式PCR中產(chǎn)生的最佳DNA簇。
對擴增后的文庫中的分子進(jìn)行精確的定量檢測，對于確保片段的質(zhì)量和高效的獲得數據是非常重要的。低估擴增文庫中的分子數量，會(huì )導致混雜的信號以及難以解析的數據；相反地，高估分子的數量會(huì )降低結合模板的珠子或者DNA簇的產(chǎn)量，并且沒(méi)有充分利用測序能力。
Real-time PCR能夠特異性的定量檢測兩端結合有適配子的DNA分子，因此能夠對擴增文庫中的分子進(jìn)行高度精確的定量檢測。Real-time PCR的靈敏性非常高，可以對濃度非常低的文庫分子進(jìn)行定量檢測，即使其濃度低于傳統方法可以檢測的閾值。因此，這種方法能盡量減少對文庫的擴增，降低可能的偏倚。
用于決對定量檢測的數字PCR
數字PCR能夠對二代測序的文庫進(jìn)行絕對定量檢測，而不需要標準品。這個(gè)技術(shù)對文庫進(jìn)行有限的稀釋?zhuān)⑦M(jìn)行大量獨立的PCR反應；因此，大多數反應沒(méi)有模板，得到陰性的結果。一個(gè)單獨的陽(yáng)性PCR反應統計為一個(gè)單獨的模板分子。通過(guò)統計所有陽(yáng)性PCR的數量，能夠確定文庫分子的絕對數目。數字PCR的主要優(yōu)點(diǎn)在于：

• 單分子的敏感性
• 與PCR擴增的效率無(wú)關(guān)，因為成功的擴增被統計為一個(gè)分子，而與最終產(chǎn)物的數量無(wú)關(guān)

 
但是，這種技術(shù)需要特殊的儀器，并且花費較高，因此尚未廣泛用于文庫定量檢測。
宏基因組學(xué)Metagenomics 
DNA測序的應用領(lǐng)域之一是宏基因組領(lǐng)域，即從環(huán)境樣本中直接回收的遺傳物質(zhì)的非培養研究。宏基因組學(xué)是指一個(gè)環(huán)境樣本中所包含的所有微生物基因組的功能和序列分析。這個(gè)詞匯起源于“meta”（在這里指對于基因多樣性的系統性理解）和“genomics”（對一個(gè)物種的遺傳物質(zhì)的綜合分析）。
宏基因組不是一個(gè)新的學(xué)科，但由于二代測序技術(shù)所帶了的諸多可能性，宏基因組的應用經(jīng)歷了巨大的提升。
據估計，微生物中僅有1%左右是可培養的，因此宏基因組學(xué)的研究能極大的拓展我們對于環(huán)境的認識。
很多年以來(lái)，“宏基因組”這個(gè)詞匯僅與環(huán)境樣本的分析有關(guān)，比如，分析從極端的生存環(huán)境下分離得到的DNA，以便發(fā)現能用于工業(yè)的新的生物催化劑。但是，通量的極大提高，以及所花費的費用和時(shí)間的降低，將這個(gè)領(lǐng)域的應用擴展到了很多其他方面。
宏基因組學(xué)可分成幾個(gè)領(lǐng)域，包括： 

• 病理基因組學(xué)/感染基因組學(xué)
• 微生物組分析
• 環(huán)境宏基因組學(xué)

注：這并不是全面的分類(lèi)，研究者可以選擇其他的分類(lèi)標準。 
病理基因組學(xué)/感染基因組學(xué)和疾病的診斷相關(guān)，用于確定有疾病癥狀的患者體內未知的病原體。這通常是極具挑戰性的過(guò)程，因為微生物的數量可能非常少（每毫升血液中大概有1–10個(gè)細胞）。
與之相反，微生物組分析則涉及到數量巨大的微生物，比如口腔或者直腸拭子中的微生物。此時(shí)，我們的目標是分析這些菌群的組成?？紤]到人體僅包含1%的人類(lèi)細胞而其它99%都是微生物細胞，微生物組分析在未來(lái)的診斷技術(shù)中有潛在的巨大應用。更多細節，請見(jiàn)人類(lèi)微生物組工程(www.hmpdacc.org)。 
環(huán)境宏基因組學(xué)的目標除了包括傳統的尋找新的生物催化劑之外，還包括研究和鑒定棲息環(huán)境。 
從理論上來(lái)講，環(huán)境宏基因組學(xué)有兩種不同的研究方法： 

• 全基因組分析：對所有存在的DNA進(jìn)行測序
• 16S分析：僅對16S rRNA DNA進(jìn)行測序

第一種方法只是簡(jiǎn)單的對樣本中存在的所有DNA進(jìn)行測序。這可以完整地描繪所有出現過(guò)的微生物，并且可能發(fā)現新的酶或者酶家族，以及抗生素的抗性。另一方面，這種方法需要較高的測序能力，因而，相對于第二種方法，其通量較低并且花費較高。與此相關(guān)的進(jìn)一步的方法正在研發(fā)。
在宏基因組的應用中，通常需要能提供較高的片段長(cháng)度的測序儀，這是因為通常沒(méi)有參考序列可供參照。對于16S rRNA分析而言，測序儀的讀長(cháng)需要覆蓋整個(gè)區域（另請參照二代測序儀）。

RNA 測序
RNA測序（RNA-seq）是使用深度測序技術(shù)來(lái)研究生物體轉錄組的方法。此方法在構建合適的文庫之后，對樣本中的RNA直接測序，得到豐富的數據集以進(jìn)行分析。這項技術(shù)的高靈敏度和高分辨率使得它成為研究整個(gè)轉錄情形的有價(jià)值的工具。數據的定量性以及測序技術(shù)的高動(dòng)態(tài)范圍使得其對基因表達的分析具有高度的靈敏性。數據的單個(gè)堿基的分辨率提供了關(guān)于單核苷酸多態(tài)性(SNP)、選擇性剪接、外顯子/內含子邊界、非翻譯區及其它元件的詳細信息。除此之外，RNA-seq不需要預先知道參考序列，這使得從頭的轉錄組分析和新的變異體和突變體的檢測成為可能。RNA-seq是研究轉錄組的強大、革命性方法，但是使用這種技術(shù)需要非常仔細以獲得最高質(zhì)量的數據。 
RNA-seq中需要考慮的因素 
第一個(gè)需要考慮的因素是樣本富集?？俁NA通常只包含比例很少的編碼RNA或者功能RNA；樣本中大部分RNA是核糖體RNA（rRNA：大約占到了總RNA的80–90%）和較少的轉運RNA (tRNA)。為了避免將80–90%的測序資源用在重復的rRNA序列上，通常在測序之前，需要從樣本中去除rRNA。這通?？梢酝ㄟ^(guò)特定的消耗rRNA實(shí)現，也可以通過(guò)使用寡聚胸腺嘧啶富集技術(shù)選擇性富集Poly A實(shí)現。消耗rRNA的方法可以同時(shí)保留編碼RNA和非編碼RNA（一項非常重要的研究?jì)热荩┑男畔?，而Poly A富集則僅保留了編碼mRNA。Poly A富集可能會(huì )丟掉特定的RNA和具有高轉換率的RNA。  
有一些其他的方法可以避免rRNA的影響，比如選擇性降解大量轉錄物，或者不擴增rRNA的擴增技術(shù)。但是這些方法不像rRNA消耗或者poly A富集那么常見(jiàn)，并且可能扭曲轉錄物表征的正常水平。 

另外一個(gè)需要考慮的因素是要研究的RNA的大小。RNA轉錄物跨越比較大的大小范圍；與常規的RNA分析相比，關(guān)注小RNA的實(shí)驗（比如microRNA或者長(cháng)度范圍在15–35bp的RNA），需要特別的純化和文庫構建方案。大多數其他大小的RNA片段可以同時(shí)測序（RNA測序的常用步驟之一是將RNA分割成普通長(cháng)度，比如200–300 nt長(cháng)度的片段）。

RNA-seq測序操作步驟 
一旦確定了移除核糖體的方法和要研究的片段大小，就可以將RNA構建成一個(gè)文庫。對于大多數測序儀器而言，這包括首先將RNA打碎成片段，其次通過(guò)逆轉錄方法構建雙鏈cDNA。在后續的文庫構建過(guò)程中，這些雙鏈的cDNA被當作普通的基因組DNA來(lái)對待。如果想要保留RNA的直接信息（鏈型），必須使用修改過(guò)的文庫構建方案，比如將mRNA與連接適配子直接相連，或者標記cDNA的一條鏈以便在測序之前移除。 
在進(jìn)行測序計劃過(guò)程中，需要考慮三個(gè)主要的因：測序深度、讀長(cháng)和是否使用雙端測序數據。測序深度可以提供RNA轉錄物的豐度信息，并且較大的測序深度使得對于稀有轉錄物的檢測更加靈敏。讀長(cháng)也很重要，因為較長(cháng)的讀段對于檢測剪接事件更加靈敏（內含子–外顯子邊界，外顯子–外顯子邊界）。雙端測序數據能提供更多關(guān)于轉錄物結構的信息，特別是相互分隔的較遠的外顯子。一般而言，從頭分析以及尋找新的結構變異要求較高的測序深度和讀長(cháng)，并且會(huì )得益于雙端測序數據。典型的測序應用包含100–200 M片段，長(cháng)度為2 x 50–100 bp。與之相反，表達分析得益于較高的測序深度，但是讀長(cháng)和雙端測序數據則對結果的改善作用較小。這方面應用的一個(gè)典型實(shí)驗包含10–30 M片段，讀長(cháng)為1 x 35–100 bp。
基因調控研究 
二代測序技術(shù)也是研究基因調控網(wǎng)絡(luò )的強有力的工具。比如ChIP-seq技術(shù)(染色質(zhì)免疫共沉淀測序)可以用于分析蛋白-DNA的相互作用。二代測序技術(shù)也能用于確定基因組的全局甲基化模式。 
ChIP-Seq 
染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)(ChIP)是用于研究轉錄因子和修飾組蛋白基因調控機制的強大、多功能方法。這種技術(shù)用于確定活細胞中染色質(zhì)上那些與轉錄因子、共調節因子、修飾組氨酸、染色質(zhì)重塑蛋白或者其它的核因子相互結合的區域。 
整個(gè)操作過(guò)程非常耗時(shí)，包含了很多步驟和變量，每一個(gè)步驟都需要研究者根據自己的模型體系進(jìn)行優(yōu)化。將細胞與甲醛交聯(lián)之后，將染色質(zhì)中共價(jià)相連的基因組DNA和核因子復合物分離出來(lái)，然后經(jīng)過(guò)超聲波處理，剪切成可以處理的大小?？贵w與目標核蛋白特異性免疫共沉淀時(shí)，也將與這些核蛋白特異性結合的基因組DNA也沉淀下來(lái)了。去除化學(xué)交聯(lián)并經(jīng)過(guò)核酸純化處理的這些DNA可用于測序、基于微陣列的基因組雜交或者PCR擴增。ChIP與二代測序技術(shù)聯(lián)用（ChIP-Seq）可研究與感興趣蛋白相結合的位點(diǎn)在基因組的范圍內的分布。與微陣列分析(ChIP-Chip)相比，ChIP-Seq技術(shù)提供了較高的空間分辨率，動(dòng)態(tài)范圍和基因組覆蓋度，因而它對于DNA結合位點(diǎn)的檢測具有超級的靈敏度和準確度。另外，ChIP-Seq技術(shù)通常只要很少的起始樣本輸入量，并且不需要雜交探針，具有較高的靈活性，任何測序過(guò)基因組的物種都可以使用這種方法進(jìn)行研究。
高效的ChIP-Seq過(guò)程需要優(yōu)化幾個(gè)關(guān)鍵的變量。首先，甲醛交聯(lián)的溫度和時(shí)間需要優(yōu)化。如果蛋白和DNA交聯(lián)的過(guò)于緊密，則在測序之前無(wú)法將染色質(zhì)有效地打碎成片段，并且去除交聯(lián)也會(huì )遇到困難。通常情況下，最好以在37°C下與1%的甲醛共培育10分鐘起始，然后在此基礎上進(jìn)一步優(yōu)化。
有幾種不同的方法可以將染色質(zhì)打成碎片，比如超聲波和酶消化（比如使用微球菌核酸酶）。如果使用二代測序技術(shù)來(lái)分析免疫共沉淀的DNA，染色質(zhì)碎片的大小應在大約100–300核苷酸長(cháng)度范圍內，并且每一個(gè)測試系統中（細胞的類(lèi)型、組織的類(lèi)型），將染色質(zhì)打碎成片段的參數也需要嚴格優(yōu)化。
ChIP實(shí)驗的成功與否取決于所使用的抗體的量和特異性。最好選用能從多家抗體廠(chǎng)商處獲得的，經(jīng)過(guò)ChIP實(shí)驗驗證的抗體。為了確定抗體能特異性地沉淀目標蛋白，可以使用蛋白印跡技術(shù)檢測核提取物。如果在結果中，僅能觀(guān)察到一條特定大小的條帶，則可認為該抗體是特異性的。使用選定的抗體進(jìn)行免疫共沉淀，然后通過(guò)蛋白印跡分析技術(shù)確定抗體是否能特異性的沉淀目標蛋白。如果這樣的實(shí)驗失敗了，那么還可以將選定的抗體與培養的細胞進(jìn)行免疫熒光試驗。如果僅有細胞核顯色，則說(shuō)明抗體至少能特異性的識別一種位于細胞核內并可結合到DNA上面的蛋白。
根據目標蛋白的豐度，經(jīng)過(guò)驗證的抗體的量以及用于免疫共沉淀的染色質(zhì)的量必須經(jīng)過(guò)優(yōu)化，以便獲得足夠的DNA進(jìn)行測序。對于識別組蛋白和組蛋白修飾的抗體而言，每一次免疫共沉淀反應大概需要100，000到1百萬(wàn)個(gè)細胞中的染色質(zhì)。如果轉錄因子與DNA結合的動(dòng)態(tài)性較高或者與組蛋白相比，僅在有限的基因組位點(diǎn)上結合，那么實(shí)驗就需要更多的染色質(zhì)。為避免多余的抗體與非目標蛋白和染色質(zhì)的非特異性結合，同時(shí)保證能沉淀足夠多的目標蛋白，每一次免疫共沉淀反應使用的抗體的數量也非常重要。通常而言，1–10 μg的抗體即可得到合理的結果。
可以用對照反應來(lái)比對ChIP反應的特異性。在平行的ChIP反應中，使用同樣數量的染色質(zhì)，可以使用同型的對照抗體或者沒(méi)有抗體的珠子用來(lái)比照抗體和珠子與蛋白和染色質(zhì)的非特異性的結合。通過(guò)比較陰性對照樣本和ChIP樣本中在特定位點(diǎn)沉淀的DNA的量，能計算這個(gè)位點(diǎn)的富集因子。但是，在這種免疫共沉淀對照實(shí)驗中得到的沉淀物的量通常很少，不足以提供足夠的片段進(jìn)行二代測序。因此，ChIP-Seq實(shí)驗通常使用輸入對照樣本作比對。在這種情況下，每個(gè)ChIP反應中通常有1%交聯(lián)并且打碎的染色質(zhì)被用來(lái)去除交聯(lián)并且與沉淀的樣本一同純化并進(jìn)行后續的深度測序。這使得我們可以比對由于打碎染色質(zhì)所引起的偏移，這些偏移表現在染色質(zhì)的局部結構，DNA擴增，測序，拷貝數量的變化，以及測定基因組區域的能力。 
在沉淀的DNA碎片去除交聯(lián)和純化之后，建議使用real-time PCR技術(shù)確認與目標蛋白結合的基因組位點(diǎn)的回收和富集效果。通過(guò)比較輸入對照組與ChIP樣本的qPCR結果，可以計算出輸入物質(zhì)的回收比例（ΔC_T方法）。如果使用了同型對照抗體樣本（或者空白珠子的對照樣本），則可以與ChIP樣本相互比對，以進(jìn)一步對qPCR技術(shù)檢測到的位點(diǎn)的富集進(jìn)行定量分析(ΔΔC_T方法)。
為了能穩定地構建二代測序文庫，至少需要10 ng的ChIP DNA。因此，必須仔細的定量免疫共沉淀得到的DNA。但由于每一次ChIP反應得到的總的DNA量通常很低，因此需要比吸光光度定量法更加靈敏的方法。熒光測定方法（比如使用PicoGreen）在定量ChIP DNA時(shí)具有較高的靈敏度和動(dòng)態(tài)范圍。如果仍然沒(méi)有得到足夠的DNA，可將從幾次ChIP反應所得到的所有物質(zhì)可以放到一起，用來(lái)構建一個(gè)測序文庫。
由于用于構建文庫的起始材料的數量非常低，因此在片段與測序適配子連接之后對其進(jìn)行擴增很有必要。這通常需要16–18輪PCR。太多輪的擴增會(huì )降低文庫的復雜性，因此需要確定得到足夠材料所需的最少PCR輪數。
在確定文庫的品質(zhì)（使用一些商業(yè)化的儀器，比如QIAxcel或者Bioanalyzer）和濃度（比如使用qPCR技術(shù)）之后，需要使用乳液PCR（emulsion PCR, Ion Torrent）或者橋式PCR技術(shù)（bridge PCR, illumina）對文庫進(jìn)行進(jìn)一步的擴增，然后才能用于最后的深度測序。通常而言，較短的25–36核苷酸長(cháng)度的單個(gè)讀段對于定位目標蛋白在基因組上的結合位點(diǎn)就已經(jīng)足夠了。但是，為了能夠定位更困難的區域（比如重復區域），也可以使用雙末端測序方法（2 x 25的核苷酸長(cháng)度或者2 x 36的核苷酸長(cháng)度）。所需要的總的測序讀段取決于與因子結合的基因組位點(diǎn)的數目。對于轉錄因子而言，它們僅僅和基因組上有限的幾個(gè)位點(diǎn)相結合，5百萬(wàn)–1千2百萬(wàn)讀段可能足夠了。而如果要分析修飾后的組蛋白，由于它們結合在基因組更廣泛的區域上，因此需要更多的測序讀段。通過(guò)增加測序讀段的數量，能夠改進(jìn)分析的靈敏性，從而確定親和力更弱的位點(diǎn)。一些免費的軟件（比如MACS）能用來(lái)確定比統計水平具有更多讀段的基因組區域（與局部本底相比或者與單獨測序的輸入對照樣本相比）。對于這樣的數據，上述的軟件能夠產(chǎn)生一個(gè)列表，顯示那些顯著(zhù)增加的目標蛋白的結合位點(diǎn)。
細胞收集，超聲波參數和ChIP富集得到的基因組DNA的real-time PCR分析的優(yōu)化都需要通過(guò)實(shí)驗來(lái)確定。
基于序列的甲基化分析請參考關(guān)于表觀(guān)遺傳學(xué)的試驗方案和應用指南部分。
參考文獻
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