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qPCR反轉錄kit

cDNA合成
PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)
品牌 Code No. 包裝量 價(jià)格 說(shuō)明書(shū) 數量
Takara RR047Q 20 μl反應 × 10 次 265 元
Takara RR047A 20 μl反應 × 100 次 1,980 元
Takara RR047B (A × 4) 20 μl反應 × 400 次 7,520 元
 
■ 制品內容 (Code No.: RR047A: 20 μl反應×100次量)
1. gDNA Eraser 100 μl
2. 5×gDNA Eraser Buffer*1
 		200 μl
3. PrimeScript RT Enzyme Mix I*2 100 μl
4. 5×PrimeScript Buffer 2(for Real Time)*3 400 μl
5. RT Primer Mix*4 400 μl
6. RNase Free H2O 1 ml×2
7. EASY Dilution (for Real Time PCR)*5 1 ml
 
*1 5×gDNA Eraser Buffer在反轉錄反應前使用，請務(wù)必進(jìn)行基因組DNA的除去反應。
*2 含有RNase Inhibitor。
*3 含有dNTP Mixture。
*4 含有Oligo dT Primer和Random 6 mers。
*5 制作標準曲線(xiàn)時(shí)梯度稀釋cDNA或RNA標準品的稀釋液。模板cDNA或RNA如果用水或TE Buffer稀釋時(shí)，由于受Microtube吸附作用等的影響，往往不能準確地進(jìn)行稀釋?zhuān)瑢е聦?shí)驗結果精度降低。使用本制品時(shí)，即使稀釋至低濃度也能夠進(jìn)行準確地稀釋?zhuān)菀自趯拸V范圍內獲得準確定量的標準曲線(xiàn)。本制品不影響反轉錄和PCR反應，用其稀釋后的樣品可直接使用。EASY Dilution (for Real Time PCR) (Code No. 9160/9160Q) 也可以單獨購買(mǎi)。
注意：EASY Dilution (for Real Time PCR) 請與本公司Real Time PCR試劑組合使用，對于其他公司的同類(lèi)制品的適用性本公司尚未進(jìn)行確認。 
 
■ 制品說(shuō)明
為了準確地進(jìn)行基因表達量分析，必須滿(mǎn)足只有cDNA作為模板檢出的先決條件，但Total RNA中常?；煊谢蚪MDNA，并可以直接作為PCR反應的模板進(jìn)行擴增，因此會(huì )造成解析結果不準確。為了避免這種情況發(fā)生，通常將檢測用引物設計在內含子前后的外顯子上，使基因組DNA得不到擴增。但是，此方法不適合具有單個(gè)外顯子的基因或兩個(gè)外顯子之間所跨的內含子過(guò)小的基因，同時(shí)當基因組上有偽基因存在時(shí)、或設計引物對基因組有非特異性擴增時(shí)、以及基因信息沒(méi)被完全解析的生物種等也同樣不適合于本方法。在這種情況下，我們常常需要對Total RNA樣品進(jìn)行DNase I處理，以除去殘存的基因組DNA。而DNase I處理通常要進(jìn)行復雜的純化操作，同時(shí)會(huì )造成RNA的降解和損失。
PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser是可以除去基因組DNA進(jìn)行Real Time RT-PCR反應的專(zhuān)用反轉錄試劑。Kit中使用了具有較強DNA分解活性的gDNA Eraser，通過(guò)42℃，2 min即可除去基因組DNA。同時(shí)由于反轉錄試劑中含有抑制DNA分解酶活性的組分，經(jīng)過(guò)gDNA Eraser處理后的樣品可以直接進(jìn)行15 min的反轉錄反應合成cDNA，因此，20 min內即可迅速完成從基因組DNA去除到cDNA合成的全過(guò)程。
使用本制品合成的cDNA適用于SYBR® Green qPCR分析法和探針qPCR分析法，可以根據實(shí)驗目的，選擇與SYBR Premix Ex Taq? II (Tli RNaseH Plus) (Code No. RR820Q/A/B)、Probe qPCR Mix (Code No. RR391S/A/B) 組合使用。
注意：Takara Bio使用SYBR Green I 作為研究試劑已得到Molecular Probes Inc.的許可。
 
■ 保存
-20℃。
 
■ 試劑盒特長(cháng)
1. 含有去除基因組DNA的gDNA Eraser，只需2 min即可除去基因組DNA。
2. 只需15 min即可高效合成Real Time PCR反應用模板cDNA，是進(jìn)行2 Step Real Time RT-PCR反應的理想試劑。
3. 反轉錄引物使用了Random 6 mers和Oligo dT Primer混合的RT Primer Mix，可以均勻合成樣品中的各種cDNA。 
4. 本制品提供了SYBR Green qPCR分析法和探針qPCR分析法各自適合的反應體系，可以根據分析方法選擇體系。
SYBR Green qPCR分析法和探針qPCR分析法區別如下：
(1) 反轉錄反應中RT Primer Mix的用量。
(2) 反轉錄反應中總RNA的用量。
5. Real Time RT PCR定量需要建立標準曲線(xiàn)，建立標準曲線(xiàn)的條件就是需要將總RNA和反轉錄cDNA稀釋到較低的濃度。如果用水或TE Buffer稀釋時(shí)，由于模板濃度低不穩定，因而會(huì )縮小曲線(xiàn)范圍，結果精度降低。本制品中附加了標準曲線(xiàn)制作用稀釋液EASY Dilution (for Real Time PCR) ，將Total RNA或cDNA稀釋至低濃度時(shí)也能夠進(jìn)行準確稀釋?zhuān)菀自趯拸V范圍內獲得準確定量的標準曲線(xiàn)。 
 
■ 注意事項
1．使用本制品合成的cDNA與SYBR Green I關(guān)聯(lián)制品組合使用時(shí)，建議使用：
SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) (Code No.RR820Q/A/B)
SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) (Code No. RR420Q/A/B)
以上制品與本制品組合使用，可以得到可信度高的結果。
本制品與SYBR Fast qPCR Mix (Code No. RR430S/A/B) 組合使用時(shí)，有時(shí)反應性能不好，不推薦使用。 
2. 當同時(shí)需要進(jìn)行數次反應時(shí)，應先配制各種試劑的混合液 (Master Mix；其中包括RNase Free dH2O、Buffer、酶等)，然后再分裝到每個(gè)反應管中。這樣可使所取的試劑體積更準確，減少試劑損失，避免重復分取同一試劑。同時(shí)也可以減少實(shí)驗操作或實(shí)驗之間產(chǎn)生的誤差。
3. gDNA Eraser和PrimeScript RT Enzyme Mix I 在使用前要小心地離心收集到反應管底部。由于酶保存液中含有50%的甘油，粘度高，分取時(shí)應慢慢吸取。同時(shí)，要使用精確、量程適合的移液槍?zhuān)⑶也灰筎ip插入液面過(guò)深，否則會(huì )因Tip壁粘著(zhù)造成損失，而使酶量不足。
4. 5×gDNA Eraser Buffer和5×PrimeScript Buffer 2（for Real Time）在使用前需Vortex振蕩混勻，輕輕離心后使用。
5. 分裝試劑時(shí)務(wù)必使用新的槍頭 (Tip)，以防止樣品間污染。