Cellartis®干細胞研究用系列產(chǎn)品介紹之
DEF-CS：?jiǎn)蝹€(gè)干細胞基因操作實(shí)驗的理想選擇
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1. 單個(gè)干細胞基因操作的必要性
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TALEN和Crispr-Cas9這些新方法的出現，使得對于細胞某個(gè)核酸區域可以進(jìn)行相當準確的靶向攻擊。但是，到目前為止，這些方法還不能做到把目標核酸位點(diǎn)進(jìn)行劇本式的改造。通常，都是在基因操作后，對于得到的細胞進(jìn)行目標核酸測序，寄希望于在這些候選的克隆中（clones）篩選得到理想的基因改造結果。
設想一個(gè)例子，假設某研究團隊想研究某個(gè)調控基因的啟動(dòng)子區域是如何參與基因調控的。他們利用Crispr-Cas9定點(diǎn)地攻擊這個(gè)目標啟動(dòng)子。根據Crispr-Cas9的特點(diǎn)，在某一次這種定點(diǎn)攻擊后，核酸傷口（DNA lesion）通過(guò)修復機制可以愈合，而愈合的過(guò)程會(huì )造成許多不同的后果，可能是增加了新的堿基，可能是減少了堿基，可能是堿基替換。對于研究團隊來(lái)講，他們希望獲得盡可能多樣化的愈合結果，這樣才能在后期的分析中，獲得在啟動(dòng)子中哪個(gè)或是哪些堿基是起作用的。
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2. 單個(gè)干細胞基因操作的困難
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目前，單個(gè)干細胞基因操作存在的巨大挑戰發(fā)生在基因操作后的細胞恢復過(guò)程。干細胞在基因操作過(guò)程中，需要經(jīng)歷幾個(gè)如轉染、電擊等破壞性過(guò)程，這對細胞活性是個(gè)挑戰。更為重要的是，目前市面上主流的干細胞培養基里面，干細胞是貼壁、成集落式的生長(cháng)。這就是說(shuō)，一般地，干細胞的生長(cháng)是一個(gè)群體性過(guò)程，細胞和細胞之間的交互是個(gè)重要的因素。那么，在干細胞進(jìn)行基因操作后，需要以單細胞懸液和單細胞鋪板的形式進(jìn)行細胞恢復，這會(huì )對于干細胞的恢復生長(cháng)造成非常大的負面影響。
因此，DEF-CS是單個(gè)干細胞基因操作的理想選擇。和目前市場(chǎng)上知名的Life Technologies和STEMCELL Technologies 的相關(guān)產(chǎn)品不同的是，DEF-CS在設計上就是支持單細胞生長(cháng)的，如下圖所示，干細胞在DEF-CS培養基里的生長(cháng)方式是貼壁、單細胞平層生長(cháng)；而在mTeSR 1培養基 (STEMCELL Technologies)和 Essential 8培養基 (E8; Life Technologies)中，細胞是貼壁、成聚落（即非單細胞平層）式生長(cháng)。
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*實(shí)驗結果來(lái)源于clontech網(wǎng)站
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http://www.clontech.com/CN/Products/Stem_Cell_Research/Culture_and_Cryopreservation/xxclt_
displayImage.jsp?img CntId=109300&sitex=10022:22372:US
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3. 在維持單個(gè)干細胞活性方面，DEF-CS有顯著(zhù)優(yōu)勢
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下圖展示的實(shí)驗結果說(shuō)明，DEF-CS在維持單個(gè)細胞的恢復性生長(cháng)方面有質(zhì)的優(yōu)勢。圖中橫坐標軸代表加到培養孔（well）中干細胞懸液內所包含的干細胞數，依次是444.4個(gè)/well, 148.1個(gè)/well, 49.4個(gè)/well, 16.5個(gè)/well, 5.5個(gè)/well, 1.8個(gè)/well, 1.0個(gè)/well, 0.5個(gè)/well；縱坐標代表每個(gè)孔中經(jīng)過(guò)細胞恢復后，形成了健康的貼壁生長(cháng)細胞的百分比。在懸液包含444.4個(gè)/well的情況時(shí)，假如一共添加了100個(gè)well, 其中全部的well中出現了健康的細胞恢復生長(cháng)，形成的有效克隆率是100%；當懸液中的細胞含量大于1.8個(gè)/well時(shí)，DEF-CS與Vendor1相比，形成的有效克隆率基本一致，但是，當懸液中的細胞數為1個(gè)或0.5個(gè)時(shí)，DEF-CS的效率明顯高于其他的競爭產(chǎn)品。這說(shuō)明，DEF-CS在維持單個(gè)干細胞的活性方面，與目前市面上的產(chǎn)品比起來(lái)，有顯著(zhù)優(yōu)勢。
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*實(shí)驗結果來(lái)源于clontech網(wǎng)站
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http://www.clontech.com/US/Products/Stem_Cell_Research/Resources/Technical_Notes/DEF-CS_Single-Cell_Cloning
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4. 采用DEF-CS進(jìn)行單個(gè)干細胞傳代操作后，干細胞全能性保持上有顯著(zhù)優(yōu)勢
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做單個(gè)干細胞基因操作的研究人員，除了關(guān)心單個(gè)干細胞的存活率以外，還需確保存活下來(lái)的單個(gè)干細胞仍然保留著(zhù)發(fā)育全能性。
下面的實(shí)驗結果說(shuō)明，DEF-CS培養體系在這點(diǎn)上，具有很大優(yōu)勢。下圖是流式細胞儀的測試結果，人類(lèi)誘導多能干細胞株chiPSC22分別使用DEF-CS，vendor1，vendor2培養基，進(jìn)行單個(gè)細胞恢復實(shí)驗（即懸液中只包含1個(gè)干細胞），挑選出五個(gè)可以恢復生長(cháng)的克隆來(lái)。對于每個(gè)恢復的克隆，用兩種標記干細胞全能性的特異性抗體同時(shí)進(jìn)行檢測，第一種是TRA-1-60(藍色)，第二種是SSEA-4（粉色），綠色表示可同時(shí)檢測出這兩種抗體。觀(guān)察chiPSC22的生長(cháng)情況，發(fā)現vendor2產(chǎn)品培養體系中挑選不到恢復的克隆，而在DEF-CS培養體系中挑出的5個(gè)克隆，雙標記同時(shí)檢測出的都接近100%，細胞性表現良好的全能性；vendor1產(chǎn)品培養體系中挑出了5個(gè)克隆，而陽(yáng)性率最高達到50%，由此能說(shuō)明DEF-CS培養體系中恢復的單個(gè)干細胞克隆，可以很好地保持干細胞的全能性。
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*實(shí)驗結果來(lái)源于clontech網(wǎng)站
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http://www.clontech.com/US/Products/Stem_Cell_Research/Resources/Technical_Notes/DEF-CS_Single-Cell_Cloning
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DEF-CS產(chǎn)品信息：
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http://www.takara.com.cn/ProductShow.aspx?m=20160307140053500605&productID=20160307140359660608
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